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(無題) 削除/引用 No.2361-17 - 2013/10/22 (火) 20:39:20 - 悪地蔵 Ayako様 　TALEN未処理のゲノムDNAでqPCRがかからないという問題をまず解決される 　のがよろしいかと思います。 ここでお使いのqPCRのprimerはgenome DNAでも増幅可能な配列でしょうか？ 　cDNAをtemplateとしてgene expressionを検討する為の市販Assayは 　genome DNAでは増幅しないように作られている事が多いのでご注意下さい。 　 　qPCRをgenome DNAで使用するケースは比較的少ないですから、今後の事も 　考えて、Life TechnologiesのRNaseP assayあたりを購入するか、LINEを 　増幅する適当なqPCRを作製して検討されるのが良いかと思います。 　このあたりは予算と測定機器の種類次第ですが。 　(定量性を云々言うためのReferenceになるqPCRです) 　　genome DNAをtemplateとしたqPCRについてはLife Technologiesの 　CNV関係製品群の記載を、 　皆さんのおっしゃるPCRの増幅効率についてはTOYOBOのqPCR関係の記載を 　参考にされるとよいと思います（実験誤差の話とは違いますよ）。 　DNAの抽出法によってはPCRの増幅に差が出てきますので、検体間の 　比較を行う際には抽出法を同じものにすることは大事です。

(無題) 削除/引用 No.2361-16 - 2013/09/13 (金) 01:02:47 - 7744 >[Re:14] ぺーぺーさんは書きました : > 私は「単にゲノムDNAが取れていないだけではないか？」と考えてしまいました。 > 自分も都合上、とった事の無い組織からゲノムDNAを取ろうとしてクオリティに問題があった事がありました。 > どれだけの数の標的配列を調べたか知りませんが、ゲノムPCRにおいて複数の標的配列で「解析に使えないレベルで」増えなかったというのはやはり普通じゃないと思います。 > そのゲノムDNAの取り方、サンプルは今までルーチンにとってきた方法ですか？ > また、ゲノムDNAのクオリティはどのように評価されたのでしょうか？ ぺーぺーさんのコメントを読んで思いつきました。 取れていないというよりも、クオリティーの問題かも。 例えば、もしgDNAを回収するのにSDSが入ったlysis bufferで回収していて、DNAだからと、低温の状態を維持したまま回収したりしていると、場合によっては途中でSDSが析出して、最後まで持ち越してしまいます。 その辺りはどうよ、質問者さん？ >[Re:13] Ayakoさんは書きました : > 理解できています。2倍とか1.9倍になる原因は、鋳型やプライマーの配列の違いだけとは限らないのではと思ったのです。2倍に増えると思ってやっても毎回確実に2倍になるとは限らず、少しの実験誤差で回によっては2倍になったり、1.9倍になったりすることもあるんじゃないかということを申し上げたかったのです。 > ご理解いただけましたか？ もし「増え方が変化してしまう原因を全て答えよ」みたいな質問に対しての答えであれば、あなたの言い分は正しい。 しかし、増え方が変化するといっても、鋳型やプライマーの配列の違いが原因で増え方に違いが出るのと、実験誤差で増え方に違いがでるのとは、全く別物！！ そもそもPCRとかする時にマスターミックス作ってんじゃん？ なんのためのマスターミックスよ？ >[Re:10] Ayakoさんは書きました : > 私のトピックス「定量的PCRでは増幅されない」をご覧ください。 だからそれも肝心なところが全く足りてないんだって。 細胞からどういう組成のバッファーでgDNAをどういう風に回収したか。 濃度と純度はどの程度か。 PCRに使った酵素。 反応ボリューム。 サンプル当たりに加えたgDNAの量。 少なくとも以上を示してほしい。

(無題) 削除/引用 No.2361-15 - 2013/09/13 (金) 00:16:01 - おお >>[Re:2] おおさんは書きました : >> 1サイクルで2倍必ずなるわけでなく(なるのは理想的な条件のときだけで)、プライまーやテンプレートなどによっては1.8倍とかになったりもします。 >プライマーの場合はGC含量、テンプレートの場合はゲノムDNAに結合してるタンパク質や、その修飾状態によって変わるということでしょうか？ たいていの場合は蛋白ではないでしょう。テンプレートがPCRのdenatureの条件でプライまーがアクセスできる一本鎖の状態にすべてなっているか、完全に解離してないものが一部あったり、解離してもなにか特殊な構造をとっていたりするとプライまーのアクセスする効率がかわってきます。 あとはぷらいまー自身のアニーリング効率でそれぞれ配列がちがうので振る舞いもちがうだろうということです。

ゲノムDNA 削除/引用 No.2361-14 - 2013/09/12 (木) 22:08:06 - ぺーぺー ご質問の件につきましては、やはり、配列依存的な、場合によっては構造依存的な増幅効率の差異が影響しているので産物の量をそのまま比較することは出来ないという皆さんの意見に同意します。 それで、実際にお困りになっている問題についてです。 他の方が指摘しているか見逃しているかもしれないのですが……。 私は「単にゲノムDNAが取れていないだけではないか？」と考えてしまいました。 自分も都合上、とった事の無い組織からゲノムDNAを取ろうとしてクオリティに問題があった事がありました。 どれだけの数の標的配列を調べたか知りませんが、ゲノムPCRにおいて複数の標的配列で「解析に使えないレベルで」増えなかったというのはやはり普通じゃないと思います。 そのゲノムDNAの取り方、サンプルは今までルーチンにとってきた方法ですか？ また、ゲノムDNAのクオリティはどのように評価されたのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2361-13 - 2013/09/12 (木) 19:15:29 - Ayako >[Re:12] Rさんは書きました : > > 増幅効率について既に指摘がされていますけど、、、 > PCRにおいて、鋳型やプライマーの配列の違いが増幅効率に影響するというのが、理解できないのでしょうか。 > 理解できています。2倍とか1.9倍になる原因は、鋳型やプライマーの配列の違いだけとは限らないのではと思ったのです。2倍に増えると思ってやっても毎回確実に2倍になるとは限らず、少しの実験誤差で回によっては2倍になったり、1.9倍になったりすることもあるんじゃないかということを申し上げたかったのです。 ご理解いただけましたか？

(無題) 削除/引用 No.2361-12 - 2013/09/12 (木) 19:10:30 - R >では、２倍と1.9倍の違いは何に依存しているのでしょうか？そのときどきの操作のブレだったりそういったものですか？ そうだとしたら、毎回毎回結果がブレブレになってきますよね。あ、だからn数を増やして、ちゃんと数値化してエラーバーを付けないといけない、ということなのですね。この理解で大丈夫ですか？ 大丈夫ではないです。 増幅効率について既に指摘がされていますけど、、、 PCRにおいて、鋳型やプライマーの配列の違いが増幅効率に影響するというのが、理解できないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2361-11 - 2013/09/12 (木) 18:59:22 - Ayako >[Re:6] 7744さんは書きました : > > ちなみに1サイクルに2倍ふえるものと1.9倍増えるものを最初に同量あったとして20サイクル回すとやく2.8倍さがでます。 > では、２倍と1.9倍の違いは何に依存しているのでしょうか？そのときどきの操作のブレだったりそういったものですか？ そうだとしたら、毎回毎回結果がブレブレになってきますよね。あ、だからn数を増やして、ちゃんと数値化してエラーバーを付けないといけない、ということなのですね。この理解で大丈夫ですか？

(無題) 削除/引用 No.2361-10 - 2013/09/12 (木) 18:37:50 - Ayako >[Re:9] 7744さんは書きました : > じゃあ情報が足りな過ぎるかと。 私のトピックス「定量的PCRでは増幅されない」をご覧ください。

(無題) 削除/引用 No.2361-9 - 2013/09/12 (木) 17:51:11 - 7744 じゃあ情報が足りな過ぎるかと。

(無題) 削除/引用 No.2361-8 - 2013/09/12 (木) 17:46:23 - Ayako >[Re:7] 7744さんは書きました : > じゃあ、TALENで処理していない細胞のテンプレートをコントロールにして、1種類のプライマーセットでqPCRかければわかると思う。 > そうなんですけど、TALEN未処理のゲノムDNAもqPCRがかからないんですよ。。。全く原因が分かりません。

(無題) 削除/引用 No.2361-7 - 2013/09/12 (木) 17:40:11 - 7744 要はcell line等でTALENで遺伝子とばしたから、処理した全細胞の中で飛んでる細胞の割合を出したいのね。 じゃあ、TALENで処理していない細胞のテンプレートをコントロールにして、1種類のプライマーセットでqPCRかければわかると思う。 qPCRのマスターミックスはgDNAテンプレートでも問題ないと思うけど。 情報がないし、自分で取説読むかメーカーに確認するのが確実。

(無題) 削除/引用 No.2361-6 - 2013/09/12 (木) 17:18:33 - 7744 極端な話、PCRで増やす領域の配列を1bp増やすだけで、全く同じ条件でPCRしても増えなくなるということはあるかもしれない。 それはDNA結合タンパク云々の話の前に、もっと単純な話。 そもそもPCRをすると必ず２倍ずつ増えていくと信じていることが根本的な間違い。 あるのか知らないけど、DNA結合タンパク質や修飾が全くないテンプレートを使用したとして、超超超理想的な条件でPCRかけても、効率は２倍ではなくて、"ほぼ"２倍。 結局、おおさんの言う ちなみに1サイクルに2倍ふえるものと1.9倍増えるものを最初に同量あったとして20サイクル回すとやく2.8倍さがでます。 っていうこと。

(無題) 削除/引用 No.2361-5 - 2013/09/12 (木) 16:51:28 - Ayako >[Re:3] Rさんは書きました : > >PCR効率はポリメラーゼを使っている時点でゲノムの複製効率と置き換えて考えてもよいと思うのですが、 > > 意味が分からないです。 > in vitroでの話でしょうか。 in vitroを想定しました。PCRはある意味ゲノムを複製しているので置き換えてもよいのかと考えたのですが、誤解していますか？ >[Re:2] おおさんは書きました : > 1サイクルで2倍必ずなるわけでなく(なるのは理想的な条件のときだけで)、プライまーやテンプレートなどによっては1.8倍とかになったりもします。 プライマーの場合はGC含量、テンプレートの場合はゲノムDNAに結合してるタンパク質や、その修飾状態によって変わるということでしょうか？ > ちなみに1サイクルに2倍ふえるものと1.9倍増えるものを最初に同量あったとして20サイクル回すとやく2.8倍さがでます。 ある遺伝子のエクソン１とエクソン２をそれぞれゲノミックPCRで増幅すると増え方が全然違うのですが（もちろん全く同じ条件で行っています）、これもやはりゲノム結合タンパクやその修飾状態の違いを反映している可能性があると考えて差し支えないですか（プライマーのGC含量以外の可能性の場合）？

(無題) 削除/引用 No.2361-4 - 2013/09/12 (木) 16:47:27 - ぽぽ おお様と言っているとおり増幅効率の違いでしょう。 同じくらいのサイズのバンドが出るPCRでも プライマーや増幅される配列の中身は違いますよね。 仮に非常に特異性の高く目的の配列にしか結合しないプライマーであっても アニーリングの温度を変えれば増幅産物の量は変わります。 アニーリング温度の検討などをやったことがあるならわかるかと思います。 基本的に温度を上げればエクストラバンドは出にくくなりますが、 その分目的のバンドも薄くなるはずです。 またプライマーだけでなく、プライマーに挟まれた内部の配列も 増幅効率に影響します。 ポリメラーゼがスムーズに走る配列もあれば、そうでない配列もあります。 ということでバンドサイズが同じでも異なる遺伝子を増幅している点で ゲノム内のコピー数に言及することはできません。 たとえば同じ遺伝子内に同じバンドサイズになるような２組のプライマーを 設定したとしてもバンドの濃さは違うでしょう。 リアルタイムPCRで増幅効率がわかるような実験を組めば ある程度答えはでるとは思いますが質問の感じからしてそうでもなさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.2361-3 - 2013/09/12 (木) 16:35:10 - R 配列 (GC含量など) によってアニーリング効率、複製効率が変わることは考慮されてますか。 >PCR効率はポリメラーゼを使っている時点でゲノムの複製効率と置き換えて考えてもよいと思うのですが、 意味が分からないです。 in vitroでの話でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2361-2 - 2013/09/12 (木) 16:04:23 - おお 1サイクルで2倍必ずなるわけでなく(なるのは理想的な条件のときだけで)、プライまーやテンプレートなどによっては1.8倍とかになったりもします。なのでもしCt値だけで両者の量を比較したいなら、まず1サイクルで2倍になっているか確かめなければいけません。 ちなみに1サイクルに2倍ふえるものと1.9倍増えるものを最初に同量あったとして20サイクル回すとやく2.8倍さがでます。

ゲノミックPCRの効率について 削除/引用 No.2361-1 - 2013/09/12 (木) 15:38:35 - Ayako 続けて質問させて頂きます。 ゲノムDNAを用いてPCRをかけると、ある遺伝子Aのローカスaよりも別の遺伝子Bのローカスbの方がより増幅産物量が多くなります（増幅産物の長さはどちらも100bp程度）。cDNAレベルでは、遺伝子Aよりも遺伝子Bの方が発現量が多いため増幅産物量が多くなるのは分かるのですが、ゲノムレベルではどの遺伝子も1コピーずつしかないはずですよね（トランスジーンは除く）。なのになぜゲノミックPCRでこのように差が出てしまうのでしょうか。 PCR効率はポリメラーゼを使っている時点でゲノムの複製効率と置き換えて考えてもよいと思うのですが、cDNAレベルでも同じような結果になるということは、複製効率と転写効率は相関があるのでしょうか？ どなたかお分かりになる方いらっしゃれば、ご教示頂けますか？ よろしくお願い致します。

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