Bio Technical フォーラム

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遠心チューブについて トピック削除
No.2381-TOPIC - 2013/09/18 (水) 15:25:59 - midiprep
私の研究室ではキアゲンのmidi, maxiprepを用いてDNAを精製しています。
その過程において20,000xgで遠心操作がありますが、一般的な15、50mlチューブを使用されていますでしょうか？

なぜこのようなことを質問するかと言うと、一般的なIwakiやファルコンチューブは約10,000xgまでが許容遠心強度であります。
そのため私の研究室では20,000xgまで耐えれるチューブをわざわざ購入しています。
もし、IWAKIやファルコンチューブでも破損等が起こらないのであれば、わざわざ20,000xgまで耐えることができるチューブを買わなくて済むと考えています。

皆様方のご意見、ご経験等なんでも結構ですのでよろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.2381-21 - 2013/10/01 (火) 16:22:31 - midiprep
コメントをくださった皆様、お返事遅くなり申し訳ありません。

皆様の意見から、特に15,000xgで遠心しなくてもDNAが取れるようですので、これらの意見、経験をもとに一度私自身試してみてからチューブをどうするのか考えたいと思います。

今回、皆様のご意見をうかがうことができて大変勉強になりました。

本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.2381-20 - 2013/09/24 (火) 15:08:35 - K
> プラスミド精製キットにろ紙みたいなのがついているものもありますね。
Machery Nagelですね。
http://www.mn-net.com/tabid/1368/default.aspx

NucleoBond® Folded Filtersってやつですね。
この紙だけ売ってくれという相談を受けたという話を
出入りの代理店の人がしていました。
紙だけ売ってくれたかどうかは知りませんが。

(無題) 削除/引用
No.2381-19 - 2013/09/23 (月) 02:41:10 - おお
qiagenじゃないですけど、プラスミド精製キットにろ紙みたいなのがついているものもありますね。

(無題) 削除/引用
No.2381-18 - 2013/09/22 (日) 17:09:18 - K
文字化け部分は「ろ紙みたいに」です。

(無題) 削除/引用
No.2381-17 - 2013/09/22 (日) 17:08:16 - K
P3の後は、私はキムワイプ1枚を沪紙みたいに折って、ロートの上にのっけて濾してます。若干ロスりますが、コストと時間はどちらも節約できます。コーヒーフィルターも良い考えですね。ガーゼというのもおもしろいです。

(無題) 削除/引用
No.2381-16 - 2013/09/19 (木) 13:18:25 - おお
むかし、qiagenは使ってなかったですけど、非常にスケールのおおきな系で、P1-P3のバッファーと同じものを使ってましたが、容量が大きくてそれをカバーできる遠心機は6000gぐらいまでのものをつかってました。それで対応できるもんですよ。

確かにP3を入れたときの遠心ではふわふわしたものが沈みにくかったりしますので、クロロフォルムをいれるとか、コーヒーフィルターをつかうとか工夫がいろいろあるようです。

(無題) 削除/引用
No.2381-15 - 2013/09/19 (木) 11:45:57 - AP
研究室にある遠心機のローターが8000 rpm,　9000 xg弱が最大のしかなくって、それでアルコール沈殿していたこともありますが、収量に問題なかったです。
プラスミドはサイズも大きいし量が多いので楽勝でしょう。だいたい日常的なエタノール沈殿なんか10000 xgあれば十分ですね。プレート遠心機でエタ沈するとき（シークエンスサンプルなど）だと、せいぜい6000 xgですし（遠心時間は長めですが）。

収量を気にするなら、遠心力を上げるより、アルコールを加え混ぜてからチューブを立てて静置して時間を置いてから遠心するとか、遠心時間を伸ばしたほうが効果的なように思います。

P3を加えてからの遠心は先に書いたとおり。

(無題) 削除/引用
No.2381-14 - 2013/09/19 (木) 11:31:29 - 中年
うちは先にも書いたように、どちらのステップも3,000×g程度（スイング）でファルコンのチューブを使ってやっています。メーカーが言うとおりの収量がありますので、ひどいロスは無いのだと思っています。

(無題) 削除/引用
No.2381-13 - 2013/09/19 (木) 10:21:59 - おお
ファルコンは今使っている中で一番よわいです。

(無題) 削除/引用
No.2381-12 - 2013/09/19 (木) 09:54:16 - midiprep
みなさま

たくさんのコメントありがとうございます。
みなさまの意見がいただけ、大変感謝しています。
あと、説明不足な点、もうしわけありません。


QIAGEN Plasmid Midi Kitを使用しています。
遠心分離でDNAを精製するタイプであり、ハイスピードタイプではありません。

http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/QIAGEN_QIAGENPlasmidPurification_EN.pdf
このページ21-23にかけてみていただきたいのですが、P1-P3を加えた後の20,000xgとQFでエリューションし、イソプロを加えた後の15,000xg,
この両ステップにおいてみなさまはどのように実験されているのか知りたいです。使い捨てのチューブで実験することをかんがえています。

TSさんが紹介してくれたビオラモのチューブを現在使っていますが、フタが閉めにくく（フタが浅い）、また液が漏れやすいと言えば良いのでしょうか？密閉感がIWAKIなどよりも劣っているような印象がありますので、出来ればIWAKIやファルコンのチューブで代用できればなと考えています。

(無題) 削除/引用
No.2381-11 - 2013/09/19 (木) 06:41:38 - X1
私のところでは、イソプロパノール沈殿回収の段階で大概いつもチューブにクラックが入ります。
長らく日立Ｒ１２Ａ５ロータを使用していて、ＰＰ５０ＴＣチューブの新商品サンプルをもらうたびに試してみましたが、各社２００００ｒｃｆ対応チューブも水では問題ありませんが、水イソプロ混液で回すと１００００ｇ程度で亀裂がはいってしまいます。丸底でないＴＣチューブの限界とあきらめて、気にしながらも使っています。

(無題) 削除/引用
No.2381-10 - 2013/09/19 (木) 00:01:56 - 直輝
そのステップは、薬局で売っているガーゼを何重にも重ねたものを使ってろ過しています。もちろんシリンジフィルターでも良いですが。

(無題) 削除/引用
No.2381-9 - 2013/09/18 (水) 22:39:03 - 中年
うちも3,000×g程度でやっています。APさんの仰るように、塩析後（氷上のインキュベーション後）にクロロフォルムを50uL程度入れて振り混ぜ（振り混ぜることはゲノムが切れるので禁忌なのかもしれませんが、塩析後なので良しとしています）、その後に遠心すれば沈殿が大きな問題になったことはありません。

(無題) 削除/引用
No.2381-8 - 2013/09/18 (水) 19:56:14 - AP
そのステップはアルカリSDS処理後の塩析ですか？
メーカーはうんとはいわないでしょうけれど、10000 xgでじゅうぶんだと思います。
遠心力が半分だから、時間は倍にしようかというようなことは一応しますけれど。

それと、このステップで少量のクロロフォルムを混ぜておくと、沈殿が壁についたり浮かんだりしにくく、底のほうにきれいにパックしやすいです。遠心力を上げるよりも効果があるかも。

(無題) 削除/引用
No.2381-7 - 2013/09/18 (水) 18:05:49 - TS
paさんがおっしゃるように、20000ｇでなくてもできると思うのです。時間を延長するとかで。10000ｇでできるかどうか試してみては?

おおさんのご提案にあるように、PPの材質ですが、
ビオラモのチューブは、ファルコンと同タイプで20000ｇまで対応です。
値段もかなり安いし、これを買うとかはダメ？
http://www.bio-lab.jp/violamo.html

２種類買うのが嫌なら、ビオラモ１種類にしちゃうとか。
ちょっと透明度が低いけど、大概の用途には耐えられると思う。

(無題) 削除/引用
No.2381-6 - 2013/09/18 (水) 17:15:05 - おお
コニカルでなくって洗浄して使うPPのチューブではだめなの?
高速遠心用のガラス管もあるけど。

(無題) 削除/引用
No.2381-5 - 2013/09/18 (水) 16:25:36 - pa
ちょっとずれるかもしれませんが参考まで。現所属ラボでは、アクセスが容易な遠心機が3300 xgまでのスイングローターしかなく、やむをえずこれで全行程やってますがmaxi prepも大きな不都合無くやれています。
遠心の時間は長めにしてます。デブリ除去がやや厄介ですけど、上清を新しいチューブに移して再遠心を３回程で完全に除けます。または、Qiagenで別売りのシリンジでろ過するフィルターを使うとだいぶ楽にやれます。

(無題) 削除/引用
No.2381-4 - 2013/09/18 (水) 16:13:54 - qq
注:ステップ 7 および 8 の遠心操作の代わりに QIAfilter Kit あるいは Cartridge
を用いてろ過すると効率よく清澄化ライセートが得られます。
(www.qiagen.com/products/plasmid/LargeScaleKits 参照)

プロトコールを読むと、上の様に出ている。

(無題) 削除/引用
No.2381-3 - 2013/09/18 (水) 16:05:49 - midiprep
Pumpkinさん

ありがとうございます。
おっしゃる通りです。

業者に最安のチューブを探してもらって現在に至っているため、そのような質問はかんがえていませんでした。

(無題) 削除/引用
No.2381-2 - 2013/09/18 (水) 16:01:18 - Pumpkin
一般的な考え方として、使用における許容範囲が明記されているのに、それ以外の使い方をした場合の保証はなんらないので、自己責任でご使用くださいとしか言えないのではないですか？

「そのため私の研究室では20,000xgまで耐えれるチューブをわざわざ購入しています。」

がやっぱり正しいのではないでしょうか？
20,000xgまで耐えれるチューブで安価なものを探しています、という質問の方がしっくりくるのですが。
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