現在、Taqman probeを用いたqRT-PCRを行っております。
Real-time PCR装置はRoche社のLight Cyclerを用いております。
primerとProbeは当研究室で既に増幅が確認されているものを使用しております（PCR条件も既に最適化されている条件です）が、
ここ最近になり、NTCの蛍光強度が極端に大きくなる現象が生じたので、コンタミによる影響だと考えてアッセイ用の試薬類を全て新品にかえ、NTCの確認をしたところ問題が解消されました。
ところが、次の日に分析を行ったところ、下記のような問題に直面しました。
NTCをn=4で確認したところ、
1本：発現なし
2本：蛍光強度が確認される
（ただし立ちあがりは10copyの検量線より3サイクル後）
3本：発現なし
4本：明らかに蛍光強度が確認される
（10copyの検量線とほぼ同じ状態）
（サイクル数：50サイクル）
となりました。因みに検量線は10^5copiesから段階的に10倍希釈し10copiesで作成しておりますが、検量線は線形性、増幅効率とも特段問題がありませんでした。上記のような問題が生じるのは何が原因なのか、詳しいかたいらっしゃいましたらご教示願います。
primerは小分けにしたものを-20℃で保存し、使用時に融解して使っております。（凍結融解は多くても２〜３回です）
probeは−20℃で保存し、使用時に融解して使用。分析終了後に再度-20℃で保存しております。２〜３回使用で使い切りです。 |
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