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(無題) 削除/引用 No.244-20 - 2012/03/07 (水) 19:24:46 - AP BPBやXCの濃度は適当でいいですけれどね。サンプルのpHを変えてしまうくらい大量でなければ自分の好みの濃度でいいです。 TAKARAなんかがおまけで付けてくる、いわゆるloading bufferはbuffer成分を含んでいないのでbufferではないです（比重を高めるグリセロールなど、視認性のための色素、酵素を止めるためのSDSやEDTAのみ）。反応バッファー中で酵素処理したDNA, TEなどで保存したDNAなど、予め弱塩基性にバッファーされた溶液に加えることを想定したものです。純水に溶けたDNAに直接加えると、pHが酸性になって移動度がおかしくなったり、変性したりします。 質問の問題とは直接関係ないと思いますが、 >RNAサンプル5µlをLoading bufferと混和してウェルにアプライし、泳動・検出しましたところ RNAサンプルがバッファーではなく、純水に溶解されているなら、上記のようなLoading bufferを加えただけでは、それだけで移動度がおかしくなります。 スラブゲルでシークエンスしたいた頃、シークエンスサンプルは沈殿にしてほぼ100%のformamideで溶解するか、5倍量くらいのformamideを加えて、熱変性してそのままロードしていました。いまでもformamide変性ゲルや尿素変性ゲルで分離するときは同じじゃないでしょうか。つまりformamideの比重で十分にロードできるということです。 非変性ゲルでRNA泳動してrRNA像で品質をチェックするというのは、あくまで手抜きの簡易法です。うまくいったならそれで用は足りるかもしれませんが、それでおかしな像が出たと言っても、artifactなのか本当にRNAがおかしいのかわかりません。Northern blotで主流になっているformaldehyde gel EP法を調べて（Molecular Cloningでも読めばよし）、本格的な方法でやったら間違いないです。formamide/formaldehyde/bufferをいれて加熱変性するときに少量のEtBrをいれるという方法が主流となってきていて、これなら変性ゲルでもしっかりRNAが染まります。

(無題) 削除/引用 No.244-19 - 2012/03/07 (水) 19:08:25 - A しばらくチェックできていなくて申し訳ありません。 私が以前にお教えしたloading bufferは、1-2Xで使用する用の組成です。つまり、エタ沈のペレットをそのまま溶かして使ったり、あるいは、1:1でサンプルと混ぜて使ったりしています。 試されたみたいなのでおわかりかと思いますが、1:1でサンプルとDyeを混ぜた場合でも、十分にwellの中に沈みます。 変性ゲルで泳動されたかどうかはわかりませんが、今回95% formamide dye中で熱変性しても28Sの位置にバンドが2本出たということなので、この問題は、変性条件の問題というよりも、サンプル自体の問題の可能性が高いように思います。もう一度、サンプル回収からやり直して、そしてそれでもおかしいようなら、あらためて原因を追及するというのが良いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.244-18 - 2012/03/07 (水) 16:59:27 - donc 変性条件で泳動しましたがやはり2本のバンドが見られました。 95% Formamide dyeについては、Aさんが教えてくださった組成のうち、 BPBとXCは0.25%ではなく0.025%が適当であろうことは分かりました。 いろいろと教えて頂きありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.244-17 - 2012/03/07 (水) 16:39:13 - ~ あ、組成はAさんが書かれていましたね。 私はグリセロールやホルムアルデヒドも入ったバッファーを使っていますので使ったことがありません。 95% Formamide dyeと書かれたプロトコルはありますし、ホルムアミドの比重は約1.1です。 なにより、自分で試せば間違いないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.244-15 - 2012/03/07 (水) 14:21:47 - ~ 全組成が書かれていない溶液の使用方法を聞かれても困りますが、 心配ならば、RNAを溶かした溶液（TE?）と１：１で混ぜて、水に沈んであまり広がらないことを確認するのが早いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.244-14 - 2012/03/07 (水) 08:47:09 - + とりあえず、その条件でやってみようぜ！せっかく人から教わったんだし!! 不安なら本を読んだ方がいいよ！

追加の質問 削除/引用 No.244-12 - 2012/03/06 (火) 14:31:49 - donc 95% Formamide dyeにはグリセリンが含まれていませんが、 これとの混和サンプルをwellに注入しても十分沈み込むのでしょうか？ 知らないことだらけで恐縮ですが、教えて頂けますと幸いです。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.244-11 - 2012/03/06 (火) 14:25:22 - ~ >95% Formamide dyeは、RNA solutionと1:1で混和するので 同名で別の溶液がある可能性は否定できませんので、名前ではなく組成で確認した方がいいと思いますが、 その名前で異なる組成はほぼ無いでしょうから、１：１でいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.244-10 - 2012/03/06 (火) 13:58:55 - donc ご指摘いただきありがとうございます。 勘違いをしておりました。 Aさんに記載して頂いた組成で95% Formamide dyeを調製し、 Formaldehyde Gelも各HPを参照に調製して再度行ってみようと思います。 95% Formamide dyeは、RNA solutionと1:1で混和するので よろしいでしょうか？ 重ね重ね申し訳ございませんが、回答いただけますと幸いです。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.244-9 - 2012/03/06 (火) 13:23:51 - ~ TaKaRa社の10x loading bufferは 50％グリセロール 0.9％SDS 0.05％ Bromophenol Blue ですよね。 Aさんの勧められているのは >loading bufferと混和したものを95℃, 5min熱処理して >再度泳動してみたいと思います。ありがとうございます。 では無いと思いますが。 お勧めはFormamide(とFormaldehye)を加えた後に熱変性し、 アガロースゲルもFormaldehyde Gelを使うことです。 ゲルまで変性にしなくても、変性ローディングバッファー＋熱変性で十分かもしれませんが、サンプルが貴重であれば1回で終わらせたほうが効率がいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.244-8 - 2012/03/06 (火) 11:56:26 - donc アドバイスをいただきありがとうございます。 loading bufferはTaKaRa社の10x loading bufferを サンプル中で1x になるようにして混和しています。 お察しの通り、RNAのみの溶液を熱処理してしまっておりました。。。 loading bufferと混和したものを95℃, 5min熱処理して 再度泳動してみたいと思います。ありがとうございます。 ちなみにマウス由来RNAサンプルです。

(無題) 削除/引用 No.244-7 - 2012/03/05 (月) 23:32:50 - A loading bufferは何を使っているのでしょうか。 また、文章を読む限り、RNAのみの状態で熱変性しているように思いますが、RNAを変性させる効果があるdyeと混ぜたのちに熱変性させるべきだと思います。 私は、RNAを95% Formamide dye (95% Formamide, 18mM EDTA, 0.025% SDS, 0.25% BPB, 0.25% XC) と混ぜたのち、95℃で5分処理し、氷冷したのち泳動しています。

(無題) 削除/引用 No.244-6 - 2012/03/05 (月) 22:05:41 - Harmonia いきものは？

(無題) 削除/引用 No.244-5 - 2012/03/05 (月) 15:39:35 - donc 質問者です。 さっそく70℃, 3minの熱処理をしたRNAを泳動してみましたが、 やはり2本のバンドが見られました。。。 熱処理が不十分だったのでしょうか？その他の原因でしょうか？ 度々申し訳ございませんがアドバイスいただけますと幸いです。 （ちなみに、今回はRNA溶液を70℃のヒートブロックで 　3 min加熱し、氷冷したものをLoading bufferと混和して 　wellにapplyしました。泳動は100Vで、Loading bufferの色素が 　gelの下端5mmに来るまで流しました。検出試薬はSYBR Green2です。）

(無題) 削除/引用 No.244-4 - 2012/03/05 (月) 09:46:51 - donc 熱処理、、、しておりませんでした。 さっそく熱処理したサンプルで再度泳動してみたいと思います。 ありがとうございます。

熱処理 削除/引用 No.244-3 - 2012/03/02 (金) 18:57:40 - ema 泳動前に70℃2-3minの熱処理をしてますでしょうか？ ＞28Sに相当する位置にバンドが2本見られました。 取っただけのRNAを泳動して、時々でることがあります。 熱処理でだいたい大丈夫になります。

(無題) 削除/引用 No.244-2 - 2012/03/02 (金) 18:20:05 - AP RNAサンプルに変性処理を施し、変性ゲル上で電気泳動していないならば、二次構造の出来具合で、移動度が異なるフラクションがあってもおかしくないかと。

RNAのアガロースゲル電気泳動でのトラブル 削除/引用 No.244-1 - 2012/03/02 (金) 16:38:52 - donc total RNAを抽出し、アガロースゲル電気泳動で量を確認しようとしています。 0.8%のゲルを調製し、RNAサンプル5µlをLoading bufferと混和して ウェルにアプライし、泳動・検出しましたところ、 28Sに相当する位置にバンドが2本見られました。 その下に、18Sと思われるバンドが1本見られます。 28Sのバンドが2本に解離したようになってしまったのは 何故でしょうか？ 以前、同様の実験を行った際は、特に問題なく、 28S：18S = 2:1で1本ずつのバンドが見られたのですが、、、 どなたかご教示のほどよろしくお願い致します。

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