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(無題) 削除/引用 No.2450-6 - 2013/10/15 (火) 13:58:05 - おお 臨床サンプルであれば、まあできないことはどう頑張ってもできないので、やれることから研究を展開するしかないので、これといったアドバイスもできなくて、すいません。なにかどちらのmRNAも安定性などで変わらないという間接的根拠がえられればいいかとは思うのですが、、、SNPsでXYでもいいから、いろいろ細胞株をあつめると、どちらのタイプの遺伝子も集めれるとかないですかね。そう言うのを複数しらべて、どちらか一方のmRNAの量が極端に少ないことはないとか、、、

(無題) 削除/引用 No.2450-5 - 2013/10/14 (月) 23:24:50 - ゲノム初心者 >[Re:4] おおさんは書きました : > バックアップとして(コントロールとして)lyonizationがかかってないもの、あるいは解除処理などをしたものがあり、比較できるならなおいいかと思います。あるいは実験によってはもう一方のXが凝縮したと思われるものとか、、、 > > 変異によるmRNAの安定性とか、post transcriptionの制御を何らかの形で否定したいでしょうから。上記コントロールが取れないなら、何らかの間接的なアプローチになるかもしれませんけど。 おお様、再度ありがとうございました。 そうですよね、私もコントロールとして同じ患者の正常組織がベストだと思うのですが、この入手はハードルが高くて…たとえ他の患者のサンプルと比べてqPCRを行ってもあまり意味がないような気がします。 このlyonizationを調べている患者は母親で、この子供は全身に症状があり、同じ変異を血液DNAからhomo(hemi)で認めていますので、あとは状況証拠でもいいかなと思ったのですが。

(無題) 削除/引用 No.2450-4 - 2013/10/14 (月) 23:02:50 - おお >[Re:3] ゲノム初心者さんは書きました : > おお様、ありがとうございました。 > やはり定量は難しいですよね。肉眼ではセカンドピークの波形は20％ぐらいしかなくて、最初はよい結果だと思ったのですが… 感触としてよい結果だというのはわかりますし、うまく示せばsuggestiveな一つのデーターとして扱えるかもしれません。ただ決定的なデーターではないので、発現量比を定量しなさいというような突っ込みはくると思うので、この方法でなら信用できるとだれもが思う方法論でさらに確認が必要だろうと思います。 > 例えば次世代シークエンスを使って、ディープシークエンスをしたらどうでしょうか？少しコストはかかりますが、RT-PCR後のプロダクトを100リードくらい読んで、変異部位の塩基比率が50:50ではなくて80:20とかだったら、lyonizationを示唆できないでしょうか？ バックアップとして(コントロールとして)lyonizationがかかってないもの、あるいは解除処理などをしたものがあり、比較できるならなおいいかと思います。あるいは実験によってはもう一方のXが凝縮したと思われるものとか、、、 変異によるmRNAの安定性とか、post transcriptionの制御を何らかの形で否定したいでしょうから。上記コントロールが取れないなら、何らかの間接的なアプローチになるかもしれませんけど。 >80:20とかだったら この具体的数字がどこまで妥当かは、この手のことに明るいわけでもないので、ちょっとわかりかねます。

lyonizationの証明(補足) 削除/引用 No.2450-3 - 2013/10/14 (月) 22:20:46 - ゲノム初心者 おお様、ありがとうございました。 やはり定量は難しいですよね。肉眼ではセカンドピークの波形は20％ぐらいしかなくて、最初はよい結果だと思ったのですが… 制限酵素はちょうどいいものが見つからなくて。 例えば次世代シークエンスを使って、ディープシークエンスをしたらどうでしょうか？少しコストはかかりますが、RT-PCR後のプロダクトを100リードくらい読んで、変異部位の塩基比率が50:50ではなくて80:20とかだったら、lyonizationを示唆できないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2450-2 - 2013/10/12 (土) 06:18:57 - おお シーケンス反応の波形から量比をいうのはかなり無理があると思います。最近はかなり改善されてきているかもしれませんが、ピークの高さは配列などにかなり影響されると思いますので、、、 どうしてもというなら、両者の配列を任意の比率で混ぜてstandardize出来るかやってみてもいいかもしれませんが、どこまで受け入れられるか、、、 RT-PCR後制限酵素でヘテロを分ける事(一方はきれて、一方は切れないとか)ができるなら、発現する量の比をラフに見ることができるかとおもいます。このときできれば1:1をスタンダードにおきたいところです。 制限酵素がつかえないようなばあいは、PCRプロダクトをクローにんぐベクターにほりこんで、20クローンほどシーケンスすれば極端な発現の偏りは見れるでしょう。シーケンスする数が多いほど精度がますということはいうまでもありません。 検出するための面白いアッセイケイもくめそうですが、まず樹立する必要があるので、そうするとちょっと別の話になりますし、、、

lyonizationの証明 削除/引用 No.2450-1 - 2013/10/12 (土) 00:14:16 - ゲノム初心者 いつもこの掲示板を参考にさせてもらっております。 lyonizationが起こっているかどうかを確かめるために、ある病変部分の皮膚を採取して、シークエンス解析を行いました。 gDNAからのdirect sequencingではheteroだったので、mRNAからのRT-PCRを行いcDNAを調べたところ、second peakがかなり低いmosaic(高さの異なるhetero)を示唆するような波形が得られました。 この結果から、転写の過程でlyonizationが起こっているということが推測できるでしょうか？ 私のボスは、いい結果だというのですが、同僚は、シークエンス波形はhomo、heteroとwild typeを分類するだけで、高さの評価はできないのではないかと言います。(例えばhetero変化でもAとCの波が全く重なる場合と、少しずれる場合があるが、両者とも同じheteroだということです) もしlyonizationをdirect sequencingでは証明できないとしたら、どんな実験が適しているでしょうか？ アドバイスをよろしくお願いいたします。

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