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(無題) 削除/引用 No.2479-7 - 2013/10/23 (水) 11:52:57 - おお >[Re:1] あおいさんは書きました : > lipofectamineでプラスミドを導入し、FACSによるGFPの検出で導入効率の推定を試みております。 > 293T細胞ではGFPはばっちり検出され、細胞Aでは６０−７０％程度の導入を確認しました。ところが細胞Bでは全く検出されません。 > しかしｑRT−PCRでは細胞BでもｍRNAはばっちり発現上昇を認めました。 GFPを見てるんでしょうかねぇ。。。それなら検出限界以下から、mRNAが検出されるようになったとうことですね、もしプラスミドが引っかかってなければ。 バッチリ検出されたといわれましたも、科学的じゃないのでどうもよくわからないのですが、293Tや細胞Aに比べてどうだったんでしょうか。Aに比べて3サイクルも違えば発現量で1/8とかと考えれば検出できなくてもあまり不思議ではないともおもえます(かりにplasmidがちゃんと除けていたとするならば). たしかに厳密にいうとtransfectionの効率を測ったわけではないですし、そう言う指摘もありますけど、GFPがラフに効率を反映していると思いますので、transfectionの改善をする必要性はあるとおもいます。プロモーターにconstitutiveなものを使っているとしたらですが。

(無題) 削除/引用 No.2479-6 - 2013/10/23 (水) 08:31:03 - Harmonia >FACSによるGFPの検出で 顕微鏡ではどのように見えていますか？ >ｑRT−PCRでは細胞BでもｍRNAはばっちり発現上昇 上昇比率ではなく、絶対量で293T細胞と同程度の量と言えるのでしょうか？ PCRで検出した標的は、本当にmRNAを反映していますか？ 導入した発現ベクターを検出していませんか？ （No.2479-4 - 独り言さんと同趣旨の疑問） >細胞種による導入効率の違い 細胞ＡとＢの由来組織は？ そもそも >FACSによるGFPの検出で導入効率の推定を試みて 検出されないのは、導入効率を反映していると考えないのはどうして？ >別の導入方法も検討して ではなく、「導入効率の推定」なら、別の検出方法を実施すべきでしょう。 たとえば、細胞内に入ったプラスミドの量を計るとか。

(無題) 削除/引用 No.2479-5 - 2013/10/23 (水) 05:44:41 - おお EBVは潜伏している状態の時は免疫によりウイルス陽性細胞は押さえられているようです。

(無題) 削除/引用 No.2479-4 - 2013/10/23 (水) 02:43:41 - 独り言 > lipofectamineでプラスミドを導入し、FACSによるGFPの検出で導入効率の推定を試みております。 > 293T細胞ではGFPはばっちり検出され、細胞Aでは６０−７０％程度の導入を確認しました。ところが細胞Bでは全く検出されません。 > しかしｑRT−PCRでは細胞BでもｍRNAはばっちり発現上昇を認めました。 プロモーターがCMVなど細胞腫特異性な発現でないのに、トランスフェクションはうまくいってもタンパク質発現がしないというのは、ちょっと考えにくいような。 トランスフェクションした遺伝子の発現をqPCRで見ているようですが、プラスミドのコンタミをちゃんと防いでいますか？ゲノムと違ってイントロンがないので、qPCRにトランスフェクションしたプラスミドを持ち込むと、ばっちり見えてしまうでしょう。トランスフェクションした量の100-10000分の一ぐらいでもコンタミしちゃったら。 まぁ、どちらにしても、細胞Bのトランスフェクション方法を変えないといけないとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2479-3 - 2013/10/23 (水) 02:10:02 - おお >成人ではほとんどEBウイルスに既感染とは聞いているのですが。 不死化B-cellを樹立するのに、EBVとかつかうとききますからねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.2479-2 - 2013/10/23 (水) 02:05:05 - おお >エピソーマルベクター(EBNA1,OriP含む) >今回伺いたいのは、その細胞BがEBウイルスに未感染（潜伏感染していない）の場合は、EBNA1を持っていないので プラスミドにEBNA1が入っているじゃないですか。。。

エピソーマルベクターについて 削除/引用 No.2479-1 - 2013/10/22 (火) 23:48:17 - あおい いつも参考にさせていただいております。 今とある遺伝子をエピソーマルベクター(EBNA1,OriP含む)にサブクローニングして強制発現をさせる実験をしております。 lipofectamineでプラスミドを導入し、FACSによるGFPの検出で導入効率の推定を試みております。 293T細胞ではGFPはばっちり検出され、細胞Aでは６０−７０％程度の導入を確認しました。ところが細胞Bでは全く検出されません。 しかしｑRT−PCRでは細胞BでもｍRNAはばっちり発現上昇を認めました。 細胞種による導入効率の違いの可能性もあるとは思うので、別の導入方法も検討しております。 今回伺いたいのは、その細胞BがEBウイルスに未感染（潜伏感染していない）の場合は、EBNA1を持っていないので、エピソーマルベクターを導入しても蛋白を発現しない可能性、とかも考えられるのでしょうか？ 成人ではほとんどEBウイルスに既感染とは聞いているのですが。 よろしくお願いいたします。

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