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(無題) 削除/引用 No.25-19 - 2012/01/21 (土) 00:29:14 - 酵母 皆様 2クローンしか実験していませんが、酵母を10mlの培地でカルチャーし、Zymolyaseで処理した後、QIAGENのmini prepキットで精製したDNAを用い、新品のDH5αに形質転換することで多くのコロニーを得ることに成功しました。 うまくいかなかった原因としては、 1．大腸菌の形質転換効率が低すぎた 2．使用したDNAに問題があった(収量、純度) ではないかと考えています。 皆様、ご助言ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.25-18 - 2012/01/19 (木) 07:24:36 - 酵母 中年様 方法を変えたのは、DNAの収量が低いために形質転換がうまくいかないのではと考え、より高収量にするためにガラスビーズ法で行いました。 クロンテックのキットでは抽出に使う酵母は1×1センチのパッチの半分量となっていました。一方ガラスビーズ法では5mlのカルチャーでしたので多くプラスミドが取れるのではと考えた次第です。 その分形質転換阻害するものも増えたのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.25-17 - 2012/01/19 (木) 07:17:29 - 中年 私はガラスビーズ法で得たDNAをそれ以上精製したことはありません。最初にお使いのキットをやめてガラスビース法に代えられたのは何か理由があるのでしょうか。キットを用いれば不純物の問題はクリアされるように思いますが。

(無題) 削除/引用 No.25-16 - 2012/01/19 (木) 00:24:58 - 酵母 中年様 ありがとうございます。 ガラスビーズ法で得たDNAをさらに精製するほうがよいでしょうか? その際にはどのような方法がいいでしょうか？ mini prepのカラムを用いるのがいいでしょうか? ひとまずは新品のコンピテントセルで試してみます。

(無題) 削除/引用 No.25-15 - 2012/01/19 (木) 00:17:45 - 中年 できればもう一桁上が欲しいです。また、キットで精製した標品ならたぶん問題ありませんが、グラスビーズで潰してアルコール沈殿しただけの標品には形質転換を阻害する謎の不純物が含まれているので、形質転換に用いるDNAが多ければ多いほど良いというわけではありません。少し量を振って条件を決める必要があるかもしれません。また、ゲノムDNAのコンタミはそれほど問題にならないと思いますので、ゲルから切り出すような操作はメリットよりデメリットが上回ると思います。

(無題) 削除/引用 No.25-14 - 2012/01/18 (水) 23:05:10 - 酵母 弘法様 ありがとうございます。 形質転換効率が低すぎたんですね。 コンピテントセルを新たに買いなおします。 ちなみに、どのくらいの形質転換効率が必要でしょうか?

(無題) 削除/引用 No.25-13 - 2012/01/18 (水) 22:50:34 - 弘法 酵母から安定してプラスミドを回収するには、コンピテントセルの形質転換効率が低すぎます。 エレクトロポレーションできるならそれが一番確実だと思いますが、それが難しいようならコンピテントセルを新たに買いなおして、ストックに気をつけて使うというのがそちらの現状では現実的であるように思います。うちのラボではコンピテントセルは自作ですが、実労半日の仕事で100万円分くらいできますので、試してみてはいかがですか？

(無題) 削除/引用 No.25-12 - 2012/01/17 (火) 23:08:14 - 酵母 SS様 ありがとうございます。 Aureobasidin Aはスクリーニングのときに入れていました。 DNA抽出する際のカルチャーにも入れておくということでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.25-11 - 2012/01/17 (火) 15:13:41 - SS 私が独学でY2Hを始めた当初、同じように陽性コロニーからプラスミドが抽出できないことがありました。 その時、陽性コロニーは結局真菌のコンタミだったことがわかりました。 ここまで形質転換やPCRが上手くいかないようだとコンタミの可能性も考えてしまいます。一度Aureobasidin Aで選択をかけてみてはどうでしょうか？

ダメでした。 削除/引用 No.25-10 - 2012/01/17 (火) 08:48:22 - 酵母 ガラスビーズ法で5mLの酵母からDNAを抽出し、1μLを形質転換しましたが、コロニーは生えてきませんでした。 さらに、得られた高濃度DNAからゲノムDNAを除く目的でアガロースゲル電気泳動を行い、20〜40KbpのDNAを除いて抽出してみましたが、ユニバーサルプライマーを用いたPCRでバンドが出なくなってしまいました。 何か泥沼にはまってしまっているようです。 DNA抽出→大腸菌で増幅のサイクルができないと先に進めないですね・・・ また、使用したDH5αの形質転換効率は6×10^7CFU/μgでした。 あまり高くはないようです。 やはりエレクトロポレーションしかないでしょうか･･･

(無題) 削除/引用 No.25-9 - 2012/01/11 (水) 23:30:04 - 酵母 弘法様 ありがとうございます。 コンピテントセルの状態チェック、次回の形質転換時に並行して行ってみます。 ゲノムの混入が悪さしている可能性も考え、前回抽出したDNA溶液からゲノムをゲル切り出しで除いて形質転換してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.25-8 - 2012/01/11 (水) 23:05:42 - 弘法 コンピテントセルは保存状態によっては効率が大きく落ちるので、お使いのストックで自分で測定しなおすことをお勧めします。本来の実験と平行して、10pg程度のプラスミドを使ってどのくらいの形質転換体が出るかチェックしてみてはいかがですか。

(無題) 削除/引用 No.25-7 - 2012/01/11 (水) 11:55:47 - 酵母 SS様 ありがとうございます。 5mlで培養ですか。やはりプラスミドの絶対量の問題かもしれません。 抽出したDNAを用いてPCRでインサート確認したところ、きちんと増えてきたのでプラスミドがあるのは間違いないようです。 もう少し収量を上げる方向で検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.25-6 - 2012/01/11 (水) 08:20:00 - SS 私のときは陽性コロニーをつまようじで拾って、SD/-Leuの液体培地 5mlに入れ、1〜2日くらい培養した後にガラスビーズ法でプラスミド抽出してました。 コンピテントセルはDH5αを使って、抽出したプラスミドは濃度も気にせず適当な量を入れていました。

(無題) 削除/引用 No.25-5 - 2012/01/11 (水) 00:41:39 - 酵母 形質転換について追加します。 各クローンについて、30μLの菌体に対し、DNA溶液を6μL(DNA量としては12〜30ng)加えてヒートショックを行い、SOC培地を150μL加えて1時間37℃で振盪後、無希釈、10倍希釈して100μLずつプレートに播きました。 唯一コロニーの出たプレートは無希釈のプレートで2個でした。

形質転換効率 削除/引用 No.25-4 - 2012/01/11 (水) 00:09:17 - 酵母 早速のご返信ありがとうございます。 弘法様 DH5αの形質転換効率ですが、添付書類では1×10^9/μg pUC19となっています。 774様 エレクトロポレーションですか･･･こちらのラボではエレクトロポレーションはやっていないかもしれません。 ヒートショック法では難しいのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.25-3 - 2012/01/10 (火) 23:50:14 - 774 私も同じ経験があり、その時はトランスフォームを普通のケミカル法からエレクトロポレーション法に変えたら上手くいきました。 参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.25-2 - 2012/01/10 (火) 23:47:01 - 弘法 定量的な議論をするための情報が書かれていません。例えば、お使いになったDH5αのコンピテントセルはどの位の形質転換効率のものでしょうか（μg plasmidあたり）。

酵母からのプラスミド抽出 削除/引用 No.25-1 - 2012/01/10 (火) 23:35:49 - 酵母 昨年末にY2Hのトピックでお世話になったものです。 アドバイスにありました、陽性候補コロニーからpreyプラスミドを抽出して再度酵母へ形質転換する目的で実験を行っています。 プラスミド抽出はクロンテックのEasy Yeast Plasmid Isolation Kitを用いました。 9つのクローンをSD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-a-galに1センチ×1センチの大きさでパッチし、その半分量をキットで抽出したところ、収量が2〜5ng/ulでした。 このDNA溶液をDH5αに形質転換し、LB/Ampで培養したのですが、一つを除いてコロニーが生えてきませんでした。(preyはAmp耐性、baitはKan耐性) 酵母からのDNA抽出物はゲノムを多く含み、プラスミドは少ないと聞いたことがありますが、今回大腸菌が増えなかった原因もプラスミドが少ないため形質転換がうまくいかなかったと考えるべきでしょうか? その場合、収量を上げる必要があると思いますが、どのような方法がよいかアドバイスをいただけませんでしょうか? よろしくお願いいたします。

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