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(無題) 削除/引用 No.2513-10 - 2013/11/04 (月) 11:17:29 - おお ありがとうございました。培養細胞はやはり少し事情が違うようですね。。。うすうすそんなかんじがしていました。精製にはたしかにシュークロースをつかってます。KClもてかなぁとおもったりしたのですがそこをちょっと大胆にかえると、、、どうなるかわからないというのもありまして。。。もう少しプロとコールをさがして、考えてみたいと思います。 >nucleaseを使うと良い、という人も居ます。 これも頭によぎりました。培養細胞の場合すこし死んだ細胞がでだすと、単なる遠心だけの精製ではねんちょうなDNAらしきものがまじることがあります。なので少し工夫して核をのぞいたあと、microcentrifugeでミトコンドリアが沈殿するぐらいの量のぱーこーるをいれてえんしんしています。ちょっと選択肢としてnucleaseは考えてみたいと思いますが、、、referencesがみつかればdataをpublishするときらくだなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.2513-9 - 2013/11/04 (月) 09:56:36 - aji サンプルは何でしょうか？ 肝臓や心臓のミトコンドリアは7000Gでかなりきれいに落ちてきますが、培養細胞だと細胞の種類にもよるみたいです。肝臓だったら2000Gでも落ちてきますが。 多糖類の関与を考えるときに、確かに理屈ではどう結合してるか、と考えるべきなのでしょうが、逆にバッファー中で本当に分散するのか、というのもコンセンサスは無いように思います。生体成分はそんなもんではないでしょうか。 ちなみに、ノコダゾールを加えるプロトコールもあるようです。現在、浸透圧調節に糖を使っておられるようですが、KClを使うプロトコールもあります。糖を使う場合と密度、粘性が違いますので、遠心の状況が変化するかもしれないですね。 一般論としては肝臓や心筋では糖、骨格筋ではKClを使いますが、他に案が無い時はもう一方のバッファーをよく試します。また、知人はBN-PAGEにはnucleaseを使うと良い、という人も居ます。DNAが何かと邪魔するそうですが私は試したことはありません。

(無題) 削除/引用 No.2513-8 - 2013/11/03 (日) 01:22:16 - おお >[Re:6] ajiさんは書きました : > タンパク質以外の成分、多分多糖類とかなんだと思いますが、 多糖類はミトコンドリアにどのようにassociateしているのでしょうか、、、それともmicrosomeのコンタミからの持ち込みをおかんがえでしょうか。。。それなら純度をあげる必要がありますね。。。

(無題) 削除/引用 No.2513-7 - 2013/11/03 (日) 01:17:59 - おお >[Re:6] ajiさんは書きました : > BN-PAGEだけではぼんやりしていてもさらにCBB染色するのもサンプルによっては効果的です。 CBBのあと染めはやったことがあるのですが、、、あまりいい印象はなかったです。やってきたすべてのコンディションでそうではないので、気に留めておきます。ただingel活性をみたりと次のステップの都合出来ないことがおおいです。。。どうしてもというなら、サンプルをわけて2 れーんでながすということになるかもしれません。 > ミトコンドリアの純度があげられればそれに越したことは無いと思います。 純度に関しては量との戦いもあるのでどこまでするべきかと思ったことはあります。ミトコンドリアの純度をあげても、ミトコンドリアの構成蛋白はすべて含まれるわけですし、、、くわえて脂質も除けるわけではありませんし、、、 本当かどうかわかりませんが核を除いたあと7000gぐらいの遠心で90%ぐらいの純度になるとかいたプロとコールもあります。そうすると感度のいいウエスタンで局在を見るとかでない限りかなりきれいなフラクションとしてあつかえるのかなぁと思ったこともあります。じっさいミトコンドリアの酵素活性を見るときは7000gとかの遠心で回収してすぐに見るプロとコールがおおいです。なので純度の問題だろうか、そうならばなにがどう邪魔なのかとズーと自問自答をくりかえしてきました。side by sideではありませんが、若干純度をあげてみたりしたこともありますが、改善されている感触はいまのところもってないのです。。。 いっそうのこと低ちょうで膜をこわして、内容物をだしてしまい膜フラクションだけにしようかと思ったことはあります。。。 とにかくはできるだけきれいなフラクションをとるように心がけます。

(無題) 削除/引用 No.2513-6 - 2013/11/02 (土) 23:04:22 - aji BN-PAGEでバンドが見えないのと実際のタンパク質がバンド状に流れているかは相関がないというか、スメアに見えていても活性染色では綺麗なバンドが見えることはよくあります。 タンパク質以外の成分、多分多糖類とかなんだと思いますが、そういう成分が多いとBN-PAGEのみではバンドが見えないような印象があります。 BN-PAGEだけではぼんやりしていてもさらにCBB染色するのもサンプルによっては効果的です。 ミトコンドリアの純度があげられればそれに越したことは無いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2513-5 - 2013/11/02 (土) 15:11:51 - おお さいどありがとうございました。抗体で見るレベルのりょうでもうまくいくということなのかもしれないとかんじました。 そうするとやはりサンプル調製なのかなぁと、、、塩濃度はnature protocolの2種類のバッファーとほかのグループがやっていた方法(これは塩濃度が150mMほどありnature protocolでは50mM以上では支障があるとかいていて矛盾してますが)でやったのですが、nature protocolでは場合によっては水で洗えとか書いてますので、、、もうちょっと踏み込んで改善できるか考えてみます。そもそもmitochondriaを回収するバッファーはsucroseとバッファーとEDTAぐらいで50mMも塩があるわけではないので結構らふにやってましたが。。。

(無題) 削除/引用 No.2513-4 - 2013/11/02 (土) 09:40:27 - qq ＞その前のgel imageはどんなかんじだったのでしょうか? CBB染色では、なんかうすらぼんやりしていたように思います。あいにくデータにも残していませんのでお見せできません。レーンの中が抜けるようなことはそれほどなかったように（ぼんやりと）記憶しています。 サンプルバッファーの組成が重要な気がしますが、特にbis-trisではなく、digitonin + imidazole-HCl＋aminocaproic acidを使っています。

(無題) 削除/引用 No.2513-3 - 2013/11/01 (金) 22:54:25 - おお >[Re:2] qqさんは書きました : > mitosciencesのBN-PAGEのプロトコールは、見ましたか？ > www.mitosciences.com/PDF/BNPAGE.pdf（よいのかどうかよく分かりませんが） > サンプルの組成（イオン強度や種類）が重要なのではないかと想像します。 > BN-PAGEは、ウェスタンでしか使ったことがありませんが、ウェスタンでは、いい感じにバンドを検出できました。 > > mitosciences... はい、みました。nature protocolをみて最初実験系をたてました。WBされたということですが、その前のgel imageはどんなかんじだったのでしょうか?教えていただければうれしいです。 mitosciencesのプロとコールでは400ugを40ulの容量で流すようになってますね。。。量の問題かもしれないとおもいはじめてます。 イオン強度などはいろいろ論文をよみ、同様のコンディションでやってるのですが、、、もう一度よく確かめてみます。 いみだぞーるでやっているけど、bis-trisにへんこうしようかしら。 CVはlead phosphateの沈着によるin gel activityは比較的きれいに見れていたりするだけに、、、

(無題) 削除/引用 No.2513-2 - 2013/11/01 (金) 17:16:03 - qq mitosciencesのBN-PAGEのプロトコールは、見ましたか？ www.mitosciences.com/PDF/BNPAGE.pdf（よいのかどうかよく分かりませんが） サンプルの組成（イオン強度や種類）が重要なのではないかと想像します。 BN-PAGEは、ウェスタンでしか使ったことがありませんが、ウェスタンでは、いい感じにバンドを検出できました。

BN-PAGE うまくながれません。 削除/引用 No.2513-1 - 2013/11/01 (金) 13:37:07 - おお BN-PAGE なのですが、mitochondriaのcomplexをみているのですけど、レーンの両端にすじができ、真ん中が抜けた(ほとんどそまらない)ようなかんじになり、バンドがにんしきできません。 同じようにサンプルを調整してもそう言うのがない場合とある場合があり、いまのところ何処をかいぜんしていいかけんとうがついていません。 げるは自家製でバイオラッドのミニゲルのプレートで作成しています。マーカーなどはそんなにひどいことがないのでゲルの状態ではなさそうです。 なにか改善策の検討がつく方いらっしゃいませんか?

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