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詳しくないですが、 削除/引用 No.255-10 - 2012/03/06 (火) 01:39:28 - いい 小胞体を分画、濃縮するキットなんですね。バッファーとProtease Inhibitorしか入ってないようですが、ラボにあるもので準備したら安上がりだったりしますか？ マニュアルによると、0.5gの新鮮な肝臓からTotal ER fraction: 350 ul (12 mg/ml = 4.2 mg)となっていますが、採れてきているタンパク量は同じくらいですか？ >1) 肝臓0.25gを測り、-80℃で保存 -80℃で保存という過程はマニュアル中に見られなかった気がしましたが、必須な過程ですか？ >小胞体画分と全体タンパク質溶液をどちらもタンパク質量を5 ugとしてウエスタンブロット シグナルが検出されていますので関係ないと思いますが、マニュアルでは20 ug流していますね。

(無題) 削除/引用 No.255-9 - 2012/03/05 (月) 19:22:25 - aaaa > 仮にATF6の回収率100%で小胞体に100%ATF6が来るとして、小胞体画分の1%容積と全体のたんぱく質溶液の1%容積をウェスタンして、ウェスタンのシグナルに差は無いことがよい結果だと思うのだけど、どう思う？？ つまり、Whole Cell Lysateを100ul分画してER画分が100ul得られた場合、両者を等量流してシグナルが同程度であれば、回収率は100%に近いということです。

(無題) 削除/引用 No.255-8 - 2012/03/05 (月) 19:14:23 - aaaa Whole Cell Lysateは何％inputとして流したのでしょうか？ 何ug分画してER画分は何ug取れたんですか？

(無題) 削除/引用 No.255-7 - 2012/03/05 (月) 18:28:12 - ああ ｑｑさん 説明が至らなく申し訳ありません。 ICRマウスの肝臓組織を用いて小胞体画分と全体タンパク質溶液をどちらもタンパク質量を5 ugとしてウエスタンブロットで流したのですが、ATF6のバンドのシグナル強度に差が見られませんでした。 キットの添付文書を以下に載せます。 http://www.funakoshi.co.jp/node/14534 他の分画のウエスタンブロットは現段階では行っておらず、今後行うつもりです。 また、CBB染色の結果は2種類のタンパク質溶液のバンド種類に違いはありました。しかし、ATF6だと思われる位置のバンドに強度の違いは見られていません。 ＞仮にATF6の回収率100%で小胞体に100%ATF6が来るとして、小胞体画分の1%容積と全体のたんぱく質溶液の1%容積をウェスタンして、ウェスタンのシグナルに差は無いことがよい結果だと思うのだけど、どう思う？？ この部分がよくわからないのですが、お手数ですが説明していただけないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.255-6 - 2012/03/05 (月) 16:16:38 - qq 「、、、できませんでした」ではなくて、ATF6で観察できたことを正確に記述しましょう。「正確に」とは、見ている人が再現可能な程度にと言う意味です。 ＞ATF6のバンドは確認できたのですが小胞体分画と全体のタンパク質溶液との差が見られませんでした。 １）「差が見られません」の差って一体何のことよ？もっともっと、具体的に言ってほしいね。 ２）小胞体画分（名詞で使うときは画分なんだなぁ）のいくらと、全体のタンパク溶液のいくらをウェスタンに載せたの？ ３）他の画分も当然ウェスタンで調べた？ ４）CBB染色で、たんぱく質バンドの種類に差はあったの？ 仮にATF6の回収率100%で小胞体に100%ATF6が来るとして、小胞体画分の1%容積と全体のたんぱく質溶液の1%容積をウェスタンして、ウェスタンのシグナルに差は無いことがよい結果だと思うのだけど、どう思う？？ それと、他の画分にATF6がほとんど無いことが、大切だとも思うわけですが、どう思いますか。

投稿者です 削除/引用 No.255-3 - 2012/03/05 (月) 15:14:29 - ああ ｑｑさん ご指摘ありがとうございます。 以後気をつけます。 ATF6のバンドは確認できたのですが小胞体分画と全体のタンパク質溶液との差が見られませんでした。

(無題) 削除/引用 No.255-2 - 2012/03/05 (月) 15:00:05 - qq 小胞体濃縮とはあまり言いません。小胞体分画でしょう。 ＞ポジコンとしてkitに推奨されているATF6のタンパク質の濃縮が観察できませんでした。 「、、、できませんでした」ではなくて、ATF6で観察できたことを正確に記述しましょう。

小胞体濃縮について 削除/引用 No.255-1 - 2012/03/05 (月) 14:32:51 - ああ いつもお世話になっています。 現在、肝臓の組織から小胞体濃縮して、小胞体に局在するタンパク質の検出を試みています。 キットはフナコシのendoplasmic reticulum enrichment kit（http://www.funakoshi.co.jp/node/14534）を用いて検討をしているのですが、ポジコンとしてkitに推奨されているATF6のタンパク質の濃縮が観察できませんでした。 小胞体の濃縮実験が初めてですので、どのProcessに注意すればいいか困っています。このキットを用いて実験されている方、もしくは小胞体の実験をされている方がいましたら、アドバイスの方よろしくお願いします。 簡単なプロトコルを以下に示します。 1) 肝臓0.25gを測り、-80℃で保存 2) ホモジェナイズ（kitのlysate溶液） 3) 1000g, 10min, 4℃ 4) 上清を12000g, 15min, 4℃ 5) 上清を90000g, 60min, 4℃ 6) Peletをkitの溶解bufferで溶かす

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