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(無題) 削除/引用 No.2573-9 - 2013/11/23 (土) 15:19:42 - おお すみになってますが >[Re:7] hatsuhinode_2013さんは書きました : > > さて、今回、私が読んだ論文では、抗FLAG抗体で免沈して、抗HA抗体でWBしているのに、どういう訳か、FLAG-GPCRのバンドしか出ていません。IgGのノンスペのバンドも出ていますが… これがどういうことかよくわかりませんが、両方発現させたものだけでFLAGのIPでHAのwesternをみているということでしょうか。それならネガコンガいりますよね。 > > この場合、抗HA抗体で免沈して、抗FLAG抗体でWBする必要もあると思うのですが、いかがでしょうか。 必要とまでいえません。あった方が説得力がありますが、構造的な問題などでどちらかでしかIPできないということはありえるので、片方だけでしかみれなくても、よしということはあります。 > > また、FLAG-GPCR＋Mock（HA）とHA-AP＋Mock（FLAG）のサンプルも必要だと思うのですが… HAでIPなら、HAのmockがあればことたります。HA-AP＋Mock（FLAG)は偶然なにかFLAG抗体と反応する何かが引っかかっている可能性を否定できますね。でもそこまでやっているのは少ないとおもいます。InputのWBでどちらもtransfectionしてないものをネガこんとしておいておいて、そのlysateにHAでもFLAGでもcross reactするものがないことがしめせているなら、まあdefenseはできますし。 neutralな抗体でIPしたものをネガこんにおくという方法もありますね。

(無題) 削除/引用 No.2573-8 - 2013/11/21 (木) 19:57:09 - hatsuhinode_2013 ご回答いただきました皆さま、どうも有り難うございました。

補足２ 削除/引用 No.2573-7 - 2013/11/20 (水) 18:13:13 - hatsuhinode_2013 No.2573-6の「おお」さん、有難うございます。 ＞ HA-APには、2つのSS結合があり、ホモダイマーを形成と仰っているのでコンプレックスは2:2とか2:1の可能性がないでしょうか。 HA-AP１分子内には、2つのSS結合があり、APをCOS-7に遺伝子導入して、その後WBするとモノマーとダイマーのバンドが出るという報告があります（詳細不明）。 標的の複合体は、GPCR：AP＝2：2もしくは、2：1と報告されていて、結論は出ていません。 さて、今回、私が読んだ論文では、抗FLAG抗体で免沈して、抗HA抗体でWBしているのに、どういう訳か、FLAG-GPCRのバンドしか出ていません。IgGのノンスペのバンドも出ていますが… この場合、抗HA抗体で免沈して、抗FLAG抗体でWBする必要もあると思うのですが、いかがでしょうか。 また、FLAG-GPCR＋Mock（HA）とHA-AP＋Mock（FLAG）のサンプルも必要だと思うのですが…

(無題) 削除/引用 No.2573-6 - 2013/11/20 (水) 12:28:53 - おお >[Re:5] hatsuhinode_2013さんは書きました : > 実は、今回の質問は、ある論文の実験結果の一部についてなんです。 > > 6%のβ-MEを含むサンプルをSDS-PAGEで泳動してます。 > HA-APには、２つのSS結合があり、ホモダイマーを形成しています（分子間のSS結合によるとされています）。 > まずb-MEを使っていらっしゃるので、基本的にモノマーの位置に出ると思っていただければいいかと思います。で例外があるともうしました。もしたとえば 80kDaにもバンドがみられるというなら、それが SーS結合が外れなかったバンドの可能せいと考えるのはごく自然ですが、それを証明したわけではないので、もう人工夫いると思います。 HA-APには、２つのSS結合があり、ホモダイマーを形成と仰っているのでコンプレックスは2:2とか2:1の可能性がないでしょうか。

補足１ 削除/引用 No.2573-5 - 2013/11/20 (水) 10:53:11 - hatsuhinode_2013 実は、今回の質問は、ある論文の実験結果の一部についてなんです。 6%のβ-MEを含むサンプルをSDS-PAGEで泳動してます。 HA-APには、２つのSS結合があり、ホモダイマーを形成しています（分子間のSS結合によるとされています）。 FLAG-GPCRにも分子内SS結合がありますが、HA-APとの分子間SS結合に関しては不明です。 確かに、クロスリンカーを使えば、分子間の相互作用は証明しやすくなるのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2573-4 - 2013/11/19 (火) 23:13:12 - おお ネガこんに何をおくかは、各実験で何を示すかで大事なところですし、そうするとそれぞれの実験でコントロールが変わってくる可能性もあります。そういう事を考えるというのは大変重要なことなのでご自身でよく考えてみてください。 IPならこうだとある程度いえるかもしれませんが、しかしそれはあなたの実験に限ってはよくないはんだんかもしれないというのもありますので、軽率にかくのもどうかと思いますので。 SDSは強力な変性剤です。蛋白が変性すると、従来の構造を保つことができなくなります。蛋白の相互作用は(すべてではないにしろ)相互の構造認識のような感じです(ここちょっとぼかした表現にせざるおえないですが)。 なのでSDSPAGEでは蛋白どうしの相互作用はないというのが一般的なみかたです。 ただし、わずかながら例外があります。一つの例は膜蛋白どうしだととくにボイルなどによってアグルことがある。そう言うときはもしかしたら80kDaにきてもおかしくないですし、もっと高分子のアクリケーションができる可能性もあります。 非還元状態であればS-S結合も考慮に入るかとおもいます。2-MEがはいっていても、なにかの都合でききがわるくなると、ひじょうにつよいS-S結合はもしかしたら見れるかもしれません。 CoIPのまえにクロスリンクするという手法もあるのでそう言う場合だとコンプレッすのサイズに出てくることはあります。

(無題) 削除/引用 No.2573-3 - 2013/11/19 (火) 18:26:50 - どっくそ よほど強い相互作用でない限り分離するかと思うので、 30kDa付近にバンドがでるとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.2573-2 - 2013/11/19 (火) 18:26:23 - TS SDS-pageであれば、分離されるでしょう。 ＞さらに、上記の実験でWBを行う場合、ネガコンを含めて、一緒のゲルに泳動しなければならないサンプルまでご教示下さい。 丸投げしないで、ご自分の考えを提示すべきではないでしょうか。

共免疫沈降（Co-IP）について 削除/引用 No.2573-1 - 2013/11/19 (火) 18:12:14 - hatsuhinode_2013 タグ付きの２つの蛋白の共免沈（Co-IP）に関する質問です。 FLAGタグ付き受容体（あるG蛋白共薬型受容体：FLAG-GPCR、約50kDa）とHAタグ付き修飾蛋白（ある１回膜貫通型蛋白：HA-AP、約30kDa）の複合体を証明するための実験です。 まず、抗FLAG抗体で複合体を免沈して（IP）、抗HA抗体でウエスタンブロット（WB）する場合、FLAG-GPCRとHA-APは、完全に分離された状態で泳動されることになるのでしょうか？ 上記の実験の場合、１：１の複合体であれば、80kDa付近にバンドが検出されるのでしょうか？それとも、30kDa付近に検出されるのでしょうか？ さらに、上記の実験でWBを行う場合、ネガコンを含めて、一緒のゲルに泳動しなければならないサンプルまでご教示下さい。

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