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(無題) 削除/引用 No.2582-9 - 2013/11/26 (火) 10:35:55 - ぱんだ ありがとうございます。 始めは300bp程度の長さで作成していました。 何度か変えたのですが、上手く行かなかったために180bpくらいの設計にしています。 動いている系の論文を探して、連絡してみる方法をとろうと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2582-8 - 2013/11/25 (月) 18:42:03 - AA ISHはサンプルのコンディションを除けば、 プローブの良し悪しでほとんど結果が決まってしまいます。 もちろん、DNAプローブかRNAプローブかという選択もありますが、 とりあえず、何通りも配列を用意して(あるいは長い配列のプローブを分解して) やってみるのが一番手っ取り早いのではないかと思います。 良いプローブが他のラボで使われているならリクエストしてしまうのもよいです。

(無題) 削除/引用 No.2582-7 - 2013/11/24 (日) 21:51:33 - ぱんだ 皆様ありがとうございました。 なかなかin situ hybridization法における実験がウマく行かず、色々と試行錯誤しています。 プローブもcDNAから作成し、色々確認しているのですが。。。。 色々調べているの、RNAプローブを使用しているプロトコールが多く、疑問が生まれました。 RNAプローブも視野にいれ検討しています。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2582-6 - 2013/11/24 (日) 18:30:45 - ぽん 便乗質問に迅速、的確な御回答をありがとうございました。 ぱんださん、お邪魔しました。

(無題) 削除/引用 No.2582-5 - 2013/11/24 (日) 11:48:07 - 通りすがり >ぽんさん 　最近は、普通のRNAプローブを作るのに、プラスミドは不要です。端にSP4やT7などの配列をつけたプライマーを使ってｃDNAを鋳型にしてPCRをかけ、PCR産物からIn vitro転写でプローブを作ります。かなり手軽ですよ。

(無題) 削除/引用 No.2582-4 - 2013/11/23 (土) 18:37:06 - ぴぴ LNAオリゴのプローブは 高価、 感度が低い（プローブ１つに対する蛍光色素の量が低い）

(無題) 削除/引用 No.2582-3 - 2013/11/23 (土) 17:25:56 - ぽん 便乗質問をお許しください。 免疫染色は実施なれていて、PCR等も実施なれているけど、 なかなか、組織切片中のmRNAを検出するためのin situハ イブリはハードルが高そうで、実施できないでいます。 プラスミドの調整が必要な一本鎖のRNAよりも、プライ マー合成発注と同じ感覚で入手できそうな、BNA（LNA）に 興味をもっています。Alexa標識なども受託しているよう ですし。 今後は、BNA（LNA）のような人工核酸におきかわっていか ないでしょうか？それとも、何か欠点があるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2582-2 - 2013/11/22 (金) 20:34:24 - AP RNA probeが好まれて使われる理由は、 1) RNA probeは一本鎖probeであるため、二本鎖DNAをprobeとした場合に生じる相補鎖同士のハイブリに因る干渉が起こらないこと、また、DNA-RNA hybridよりRNA-RNA hybridのほうが安定であることなどから、RNA probeのほうが数倍（たしか8倍だったか）感度が良いという報告があるため。 2) RNA probeは一本鎖であり、DNA probeは一般的に二本鎖である。ISHではanti-sense strand probeで検出されたシグナルの正当性の評価を、sense strand probeのISH像をネガティブコントロールとして行うのが常法なので（すくなくともISH手法の黎明期では）、一本鎖probeとなるRNA probeが好まれる。 3) RNA probeは非特異的に吸着し標的にハイブリしていない分子を一本鎖特異的なRNase Aで分解することによって、バックグラウンドを下げることができる。反面、バックグラウンドが上がりやすいのはRNA probeの性質という面もあり、DNA probeではそういう処理が必要とされない。 RNA probeの利点の多くは一本鎖であるというところにあります。 しかし、最近ではasynmetric PCRで一本鎖DNAプローブを容易につくる方法がありますので、そうなってくるとそれほどRNA probeにこだわる必要はないと考えます。

in situ hybridizationのプローブ 削除/引用 No.2582-1 - 2013/11/22 (金) 16:58:17 - ぱんだ in situ hybridizationの実験を行う上で、RNAプローブとDNAプローブのどちらを使うかは何によって決めるのでしょうか？ 色々調べると、RNAプローブを用いた実験が多いと感じますがDNAプローブをつかうことの欠点や注意点はあるのでしょうか？ 宜しくお願いします。

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