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(無題) 削除/引用 No.2584-3 - 2013/11/26 (火) 21:02:52 - モモ MOIは簡便にはフローで見れるのでは。

(無題) 削除/引用 No.2584-2 - 2013/11/26 (火) 09:26:50 - sh あくまで私感ですけど 1) 293細胞が目的の遺伝子20種すべてを発現しているとして、shRNAの効果を検証するのに使うのは遺伝子導入効率の高さから考えても妥当ですが、ウイルスを産生させる必要はありません。ウイルス産生による細胞毒性などを考えても、shRNAの発現ベクターのみを導入して、shRNAの効果をみるべきです。その場合、puroでの選択は必ずしも必要ではなく、トランスフェクション2-3日後に評価すれば十分です。もし、293細胞がターゲットを発現していない場合でも、目的のタンパク質の発現ベクターを同時にトランスフェクションすれば効果がみれます。 ただ、注意しないといけないことは、細胞の種類によってターゲットの発現量が異なるため、293細胞で効果がみられても実際使う細胞で効果が見れない事もあります。経験上ですが、発現量が多いタンパク質では見かけ上のノックダウン効率は高い印象があるので、特に293細胞に強制発現して効果を見た場合は注意が必要です。 3) PolII系のプロモーターを利用してmiRNA-based siRNAを発現するシステムはいくつか報告され、販売されています。このシステムの利点としては、薬剤耐性や蛍光タンパク質の後ろにmiRNA配列を付加することで、選択マーカーとsiRNAを同時に発現できることでしょうか。ステムループの配列など異なるのでshRNAの配列をそのまま使う事はできないと思います。 PolIII系とPolII系のどちらが効率がよいかは、調べてませんが、論文などありそうです。

shRNA 削除/引用 No.2584-1 - 2013/11/23 (土) 17:29:46 - レンチウィルス レンチウィルス-shRNAによる遺伝子ノックダウンにかんして皆様のご意見を伺えたら幸いです。 いまかかわっている仕事で約２０種類の遺伝子をpLKOベクターの系でレンチウィルスを作成し目的の細胞に感染させ遺伝子の発現をおとす必要があります。そこで以下の点に関して質問です。 １）ウイルスの作成に使った293T細胞自体をpuroでセレクトし（３-４日でセレクションは終わると思います）、shRNAによる遺伝子の落ちをQPCRでみて、その結果をみて次のステップ、すなわち目的細胞への感染に移ろうと考えています。このアイデアを他の研究者に話してみたところあまりよい反応は得られませんでした。仮にウイルスが高タイター取れているとするならばそれを賛成した細胞もそのタイターのウイルスに感染していると仮定してもよさそうなものだとおもいますが。。私はたいていひとつの遺伝子にたいして２つのことなるshRNAシークエンスをデザインするので、293Tで落ちが確認できないものを省けると今回のように20遺伝子落とすような仕事だと結構楽になります。皆様はウイルス作成に使用した細胞、sクリーニングなどに使用しますか？ ２）ウイルスのタイターに関して。私の印象ではウイルス感染のMOIにかかわらずpuroへの抵抗性やGFPの光具合にあまり差がないように感じています。つまりMOIが1でも10でもpuroによりセレクションはかかるということです。puroの濃度をあげても遺伝子の落ち具合などは改善されないと感じています。そこでやはりもっとも重要なのは感染時のMOIだと思います。ただp24のELIZAやクローンテックのstickでのタイターの判定も結構コストがかかるので、おまり好みません。そこで私は取れたウイルスを10倍、100倍と希釈したものを目的の細胞に感染させpuroでセレクトしています。たいていは100倍希釈と1000倍希釈の間で細胞が全滅するか生き延びるかの境界線が引けます。この生き延びるに必要であった希釈ウイルス液を簡易的にMOI1として通常はMOI10でセレクトしたものをセルラインとして樹立し実験に使用しています。MOI10でセレクトしても遺伝子の発現に変化がない場合などはシークエンスの問題と考え、オリゴをデザインしなおしています。皆様はもっと簡便で低コストなタイターの方法などご存知でしょうか？ ３）ｓｈRNAの発現はU6(RNApolIII）プロモーターを使うのが一般的と思いますが、CMVなどでも(polII)でもいくものでしょうか？　これはプロモーターレベルでshRNAの発現に改善の余地がないものかと思い質問させていただきました。 以上です。

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