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in vivo VS. in vitro enhancer活性 トピック削除
No.2590-TOPIC - 2013/11/25 (月) 11:12:30 - TK-1
ある細胞特異的に発現している遺伝子があり、その細胞特異的に現れるDnase I hypersensitivity site(DHS)がイントロンにあります。その配列含む部分はマウスとヒトでそれなりに保存されており、そのDHSを含む1.5kb程度のイントロンを欠損しているマウス（別目的で作ったものです）のホモでその遺伝子の発現が分化段階特異的に３−４倍減少しています。その配列をSV40やその遺伝子のプロモーターにつないだluciferaseのコンストラクとをセルラインにトランスフェクトした場合、レポーターの発現はほとんど変わらないか２−３倍減少します。そのセルラインでは結合している分子（未知）が発現しているとは限らないので（由来細胞は類似しています）プライマリーの細胞に入れたいですが、その遺伝子発現しているプライマリーの細胞はトランスフェクション不可です。この場合にその配列にはエンハンサー活性があるとあると結論つけるには何が必要ですか。
　
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No.2590-3 - 2013/11/26 (火) 13:23:03 - TK-1
コメントありがとうございます。

> もうほとんど答えはでていると思う。その使用した細胞がその遺伝子を発現している細胞なのであれば、そのエンハンサーは働いていると考えられます。
にもかかわらず、そのエンハンサーの効果がルシフェラーゼアッセイで見えないのは、エンハンサーではない可能性が高いです。他にその遺伝子を発現している細胞で試してもそうなのであれば、やはりエンハンサーでない。もしくはルシフェラーゼアッセイに使用しているコンストにはまだ足りない領域があるのか、無駄な領域があるのか。
この辺が妥当な解釈でしょうかね。

> KOマウスの実験は人工的なゲノムの変異でエンハンサーなのか、転写なのか、スプライシングなのかどの段階の影響なのかわからないと思う。
細胞のある分化段階ではこの配列がなくても発現は正常ですので少なくともことステージではこの配列がなくても特に影響はないようです。DHSでありhistone acetylationがあります。その次の分化段階に言った時点で発現が減少するので、何らかの分化段階特異な影響があるようですが、artifactでもこんなことがあるんでしょうか。それともたまたま？

(無題) 削除/引用
No.2590-2 - 2013/11/25 (月) 22:57:35 - 独り言
>[Re:1] TK-1さんは書きました :
>その配列をSV40やその遺伝子のプロモーターにつないだluciferaseのコンストラクとをセルラインにトランスフェクトした場合、レポーターの発現はほとんど変わらないか２−３倍減少します。そのセルラインでは結合している分子（未知）が発現しているとは限らないので（由来細胞は類似しています）プライマリーの細胞に入れたいですが、その遺伝子発現しているプライマリーの細胞はトランスフェクション不可です。この場合にその配列にはエンハンサー活性があるとあると結論つけるには何が必要ですか。

もうほとんど答えはでていると思う。その使用した細胞がその遺伝子を発現している細胞なのであれば、そのエンハンサーは働いていると考えられます。にもかかわらず、そのエンハンサーの効果がルシフェラーゼアッセイで見えないのは、エンハンサーではない可能性が高いです。他にその遺伝子を発現している細胞で試してもそうなのであれば、やはりエンハンサーでない。もしくはルシフェラーゼアッセイに使用しているコンストにはまだ足りない領域があるのか、無駄な領域があるのか。
KOマウスの実験は人工的なゲノムの変異でエンハンサーなのか、転写なのか、スプライシングなのかどの段階の影響なのかわからないと思う。

in vivo VS. in vitro enhancer活性 削除/引用
No.2590-1 - 2013/11/25 (月) 11:12:30 - TK-1
ある細胞特異的に発現している遺伝子があり、その細胞特異的に現れるDnase I hypersensitivity site(DHS)がイントロンにあります。その配列含む部分はマウスとヒトでそれなりに保存されており、そのDHSを含む1.5kb程度のイントロンを欠損しているマウス（別目的で作ったものです）のホモでその遺伝子の発現が分化段階特異的に３−４倍減少しています。その配列をSV40やその遺伝子のプロモーターにつないだluciferaseのコンストラクとをセルラインにトランスフェクトした場合、レポーターの発現はほとんど変わらないか２−３倍減少します。そのセルラインでは結合している分子（未知）が発現しているとは限らないので（由来細胞は類似しています）プライマリーの細胞に入れたいですが、その遺伝子発現しているプライマリーの細胞はトランスフェクション不可です。この場合にその配列にはエンハンサー活性があるとあると結論つけるには何が必要ですか。
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