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(無題) 削除/引用 No.2592-9 - 2013/11/29 (金) 21:29:37 - SORA 毒性が全く認められずRNA抽出も問題なくできました。 しかし、肝心のND効率が1割程度と、KDと言えるのか最早分からない程度でした。 K様の処理条件48hrを次回検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2592-8 - 2013/11/28 (木) 22:31:44 - SORA K様 有難うございます 本日16hr程度の処理でしたが、細胞毒性は認められませんでした。 ここでのアドバイスを参考にプロトコールを少し変えてみました。 あとは明日PCRでKD効率をチェックするのみです。 これで効率が悪ければ、処理時間を24〜48hrあたりで検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2592-7 - 2013/11/28 (木) 13:58:10 - K 私は48-72時間入れっぱなしです。もちろん細胞毒性が実用上問題ない実験系であるのが前提です。

(無題) 削除/引用 No.2592-6 - 2013/11/28 (木) 11:16:46 - SORA 1つお聞きしたいのですが、皆さんはsiRNA処理後、何時間で培地交換されていますか？

(無題) 削除/引用 No.2592-5 - 2013/11/26 (火) 10:49:33 - SORA PYK様 有難うございます。 siRNAは購入後、数回分に小分けして凍結保存しております。 1エッペンあたり数回分のsiRNAが保存されているため、1度ではなく2，3度は凍結融解を繰り返してしまっているかもしれませんが、、、

(無題) 削除/引用 No.2592-4 - 2013/11/26 (火) 10:45:05 - PYK siRNAを何回も凍結融解されてますか？ あまり経験はないですが、凍結融解を繰り返すとsiRNAがへたるという話は聞いたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.2592-3 - 2013/11/26 (火) 10:31:55 - SORA 独り言様 早速のアドバイス有難うございます。 実は、lipofectamine RNAiMAXも昨日同条件にて検討しました。 しかし、若干の違いはあれど、結果として細胞生存及びKD効率に大きな違いは認められませんでした。 独り言様の言うとおりsi自体の毒性もあるかもしれません。 従来ではsiRNA　final50nMで検討していましたが、論文を参考にし1/10まで濃度を落としての検討を行ったりもしましたが、当然というべきか、細胞生存への影響は小さくなったものの、KD効率がさらに低下してしまいました。 フォワードトランスフェクションにて行っています。 mixtureを作成した後、細胞への添加の際に無血清培地の1/4となるように混ぜ合わせ添加しているのですが、siの濃度ではなく、Lipofectamineの濃度をもっと落としてみた方が良いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2592-2 - 2013/11/26 (火) 02:21:51 - 独り言 同じような経験があるわけではないですが、lipofectamine RNAiMAXという試薬をsiRNAのトランスフェクションに使用してます。トランスフェクション後培地交換も必要なく、明らかにlipofectamine2000よりも毒性がないです。でも目的遺伝子が９０％近く減少できてます。 それともその毒性というのは使用しているsiRNAによる毒性なのでしょうか。

siRNA実験がうまくいかない 削除/引用 No.2592-1 - 2013/11/25 (月) 21:34:26 - SORA こんにちは。 初めての投稿なので、至らない点が多々あるとは思いますがお許しください。 以前からsiRNAの実験をしており、KD効率が約7割程度と安定していました。 しかし、ある日を境に、同条件・同プロトコールを用いて実験を行っても細胞が死んでしまい上手くいかなくなりました。 細胞の継代数を考慮にいれ、細胞を新しく起こしたのですが、改善されませんでした。 また、導入の試薬毒性を疑い、Lipofectamine2000からScreenfectAへ変更したり、siRNA濃度を落としてみたり、処理時間を16時間程度から4時間に変更してみたりなどの試行錯誤（自分なりの）をしましたが、改善されず、siRNA濃度を落としたときには3割程度のKD効率になってしまったり、処理時間が4時間のときにはむしろmRNA量が若干増加していたりと、完全に悪い方向にしか向かっていません。 どなたか同じ経験をされた方、原因が思い当たる方がいらっしゃいましたらご教授いただければ大変助かります。

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