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(無題) 削除/引用 No.2626-11 - 2013/12/08 (日) 15:00:13 - おお >[Re:10] 名無しさんは書きました : 230nmで測る理由があるかもしれないし(その方法論で決めた濃度を標準として使っていて、ほかで測るぶれが、問題になるときとか)、示されたレンジの濃度になるので、感度のよい230nmを使ってるのかもしれません。確かに10倍にしなければ測定レンジとしてはいいかもしれませんね。 たぶんさらに感度がいいとおもうのだが、UVの蛍光で測る手があります。

(無題) 削除/引用 No.2626-10 - 2013/12/07 (土) 11:33:17 - 名無し 昔から確立した蛋白質濃度の定量法はいろいろあって、その多くはいまではキット化されて市販され広く汎用されているわけで、話を読む限り、苦心してまで230nmでの定量にこだわる合理的な理由は無いような気がするんだがどうよ。時間とエネルギーを注ぐべき大事な事はなんかもっと違うところににあるような気がするんだが。 いずれにせよ濃度0.008mg／mlあたりのところで正確さや再現性をどうこう論じるのは、現実的でないというか、正直やっぱちょっとあれだろ、とか思ってて、で、assayに関する技術的な問題より、低い回収率の原因や適切でないかもしれない希釈率に注意を向けた方がよいのではないだろうか。ていうかhistone って細胞内では量は半端なく多いし、精製も容易で、回収率で苦労する蛋白質っていうイメージがないんだが、出発材料が特殊で少量しか準備できないとかなのかなあ。

(無題) 削除/引用 No.2626-9 - 2013/12/07 (土) 05:07:11 - おお qqさんに1票。 キットにしろ元にした方法論があるでしょうし、混ぜたらできるじゃなくってそういう方法論は理解していた方がいいかとおもいます。私もqqさんのように数字はきにすることがよくあります。少なくともその方法論ではどれくらい取れるとか考えた方がよさそうです。また、数字を出さなくても捨てるべき方にあるヒストンの量、あるいは インプットの量をなんがしかの方法でみれば回収量はわかります。 また回収量がたかいほうがいつもいい方法とはかぎりません。夾雑してくるものがじゃまをするので回収量を犠牲にするばあいもあります。 まあオリジナルの質問ははかれないということだったのですが、もう少し方法論的にいろいろ勉強した方がよさそうです。

(無題) 削除/引用 No.2626-8 - 2013/12/06 (金) 19:36:39 - qq ＞どうしたらいいのでしょうか？ キットから離れなさい。文献を調べたり、プロトコールを探して、組成をコントロールできる抽出液を作成しなさいね。それが、何よりの近道です。 一方、キットに固執するのであれば、それなりに努力すべきです。 １）キット名を出さないと、有効なレスは得られそうにありません。 ２）そのキットを使って最適な条件でヒストンを抽出するとどの程度のヒストンが回収できるか書いてあるんじゃないの？書いてなければ、メーカーに問い合わせる権利を持っているでしょう。 そして、その条件を自分で再現してみることです。 ３）0.008mg/mlとか言ってますが、その値はそんなもんだと思える値の”範囲”にあるのでしょうか？あんまり意味のない計算だけど、30億塩基対x２のDNAが200bpで全てヌクレオソームを形成しているとすると、約30,000,000 nucleosomes。アボガドロで割ると、5x10^-17 molesということになる。ヒストンオクタマーをMW120,000とすると、6x10^-12 g/cellということになるので、3x10^6cellsだとして、18ugのヒストン（但しH1は除く）がこの程度の細胞にあるかもしれないと考えることが出来る。抽出核タンパク全体ではもう少し多いかもしれないし、少ないかもしれない。この程度のことであれば、ヒストンを取りたいと思っていない者でも、想像することができます。あなたであれば、もっと何か考えつくかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2626-7 - 2013/12/06 (金) 19:34:48 - pa あ、すみません、全く気づいておりませんでした。280 nmですね。

(無題) 削除/引用 No.2626-6 - 2013/12/06 (金) 06:44:22 - おお あ、280ですね。260じゃなくって。けあれすみすでした。

(無題) 削除/引用 No.2626-5 - 2013/12/06 (金) 03:18:45 - pa nanodropの付属ソフトウェアの説明書を参照しているのですが、タンパク質濃度用のプリセットの設定ではすべて260 nmの数値を使うようになっているみたいです。 確かに、10倍希釈でその数値ですと230 nmで見るほうがいいかもしれないですね。nanodropを使うとすると、測定値をそのまま表示する設定にして自力で計算することになるかと思いますが、光路長が1 mm または0.2 mmで、変則的な上に自動的に切り替わってたりするのでその点注意されるといいと思います。あと最初におっしゃっているヒストン用の設定というのは260 nmの吸光度から濃度への換算の係数だろうと思うのですが、230 nmで見る際にはBSAなり精製ヒストンなりのスタンダードが必要かもしれないですね。

(無題) 削除/引用 No.2626-4 - 2013/12/06 (金) 02:33:40 - おお >[Re:3] paさんは書きました : > 手元のメモによると、nanodropではBSA換算で0.1 - 100 mg/ml　まで測定可能 (0.2 mm pathlength 使用時) ということなので、濃度が低すぎるために安定しないのかもしれません。 なるほど。これ260nmではかったばあいですか?それとも230nmで測った場合ですか?230nmのほうがかなり感度いいとはおもいますが。

(無題) 削除/引用 No.2626-3 - 2013/12/06 (金) 02:13:52 - pa 手元のメモによると、nanodropではBSA換算で0.1 - 100 mg/ml　まで測定可能 (0.2 mm pathlength 使用時) ということなので、濃度が低すぎるために安定しないのかもしれません。 機種によって範囲が違うかと思いますのでお持ちの機械について測定可能な範囲を確認されるといいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2626-2 - 2013/12/06 (金) 00:53:00 - おお よくわからないですが、振り切れてるとか、少なすぎるとかそう言うことのような気がします。振り切れる要因は、ものが多すぎるか、バッファーがその波長でかなりの吸収があるとか。。。 というような推測しかできませんが、、、

ヒストンの濃度測定 削除/引用 No.2626-1 - 2013/12/05 (木) 22:47:42 - pepper ヒストンを抽出、測定しようと思うのですが、測定結果が毎回かなりばらつきます。0.008mg/mlと出て、おかしいなと思いもう一度nano dropにのせて量り直すと0.020mg/mlだったりなどなど。。 ヒストンの吸光度は230nmにピークがあり、サンプルを10倍希釈させたうえでnanodropの設定はヒストン計測用にしてあります。この設定は間違いなさそうです。 なので、溶液中に均一に溶けていないために起こるのかなと思うのですが、ヒストン抽出キットについているbufferを用いているため、検討のしようもありません。 どうしたらいいのでしょうか？ 正確な濃度を知りたいです。

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