全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2643-9 - 2013/12/15 (日) 13:13:32 - ぴゅーろ 皆様ありがとうございます。 総合すると、抗生剤を細胞起こしたて当初から入れる方と入れない方と、いずれの意見もあり、またそれぞれに一理あって、結局のところは細胞次第なのかと思います。 皆さんの御意見を参考に、実験していきたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2643-8 - 2013/12/11 (水) 13:12:16 - おお どっちでもいいとおもう。セレクションかけたあと薬剤をつかっていじしていたらなら、遺伝子があり、その産物が細胞内にいるわけですし。導入した遺伝子が細胞の生育に悪さしていたら確かに過剰のストレスは気を使うかもしれませんが(でも遺伝子が発現しててストレスになるのと突っ込まれれば、一応ディフェンスはできるでしょうけど検証したといわれるとおそらくいい回答は帰ってこないだろうし)、細胞に発現させた遺伝子がそんなに生育に悪さしてなかったらほとんど気にならないでしょうし。じゃあそう言う細胞ではそんなに簡単に遺伝子が脱落するのといわれればあまりそうは思えないですが、使っている細胞は293Tで、SV40oriのあるプラスみどとはあまり相性がよくないらしいし、まあお好きなようにされるといいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2643-7 - 2013/12/11 (水) 10:15:47 - ぴゅーろ ~さん、ありがとうございます。 細胞株自体を自作で樹立したものなので、あまり先行情報がなくご質問させていただきました。 やはり、細胞を起こした直後には、細胞毒性のある薬剤の使用は控えたい、というのが多数派な印象ですね。

(無題) 削除/引用 No.2643-6 - 2013/12/11 (水) 09:44:17 - ぴゅーろ 独り言さんの仰るように、「保存する前からpuromycin耐性遺伝子を発現していたはず」というご意見はもっともだと思います。 また、モモさんやPさんの仰るように、基本的にちゃんとした安定細胞株であれば数日ぐらいpuromycinを入れなくてもcell lineとして使えなくなる、ということは無い気もします。むしろ私も、細胞を起こした際の、弱り目に祟り目的なpuromycinの細胞毒性の方が気になってご質問した次第です。 皆さんのご意見はいずれも合点がいくため、結局どうすべきかというのを迷ってしまいますが、 逆に細胞を起こした直後からpuromycinを入れた、もしくは入れなかったことで、悪影響が出た/困ったという経験をお持ちの方はおられないでしょうか。 最終的には、細胞による、としか言えないのかもしれませんが、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2643-5 - 2013/12/11 (水) 09:11:19 - ~ 私ならば、まずはそのストックを貰った元に起こし方を確認します。 同じ手順で操作することで、貰った元で細胞を起こして行った実験と同じ結果が期待できるでしょう。 参考となる情報源としては古い本ですが、バイオ実験イラストレイテッドの第6巻すくすく育て細胞培養を読んでみてはいかがでしょうか。 細胞を貰う際にどのような情報を聞くかについても書かれています。 貰った元というのは、別に他研究室である必要はなく、先生や先輩からもらう場合でも参考にできるでしょう。 自作のストックであれば、とりあえず起こした直後は薬剤を入れず、次の継代から入れるようにしています。 理由はPさんとほぼ同じです。

(無題) 削除/引用 No.2643-4 - 2013/12/11 (水) 08:49:22 - P 起こすときはいれないです。 クローニングしたなら、1日2日で薬物耐性ではない細胞が圧倒的に増える事なんてないですよ。 凍結した細胞を融解する時が一番細胞にダメージがあるので、極力影響がでないほうがいいかな、と思います。 入れて影響があるかは確認してないですが、入れなくても今のところ問題はありません。

(無題) 削除/引用 No.2643-3 - 2013/12/11 (水) 06:33:42 - モモ 私なら薬剤は入れませんねぇ・・・ それで目的の遺伝子が発現しなくなることはないですし。

(無題) 削除/引用 No.2643-2 - 2013/12/11 (水) 02:12:50 - 独り言 保存する前からpuromycin耐性遺伝子を発現していたはずです。だからstable cell lineを起こしたときも気にせず薬剤を入れておます。 puromycin耐性遺伝子が発現しないほと弱っていたら、そもそも死んでいるに等しいはずだし、もしくはpuromycin耐性遺伝子が発現しなくなるようなことがある不安定発現株は必要ありません。

安定細胞株の起こし方 削除/引用 No.2643-1 - 2013/12/11 (水) 01:02:27 - ぴゅーろ いつもいろいろと勉強させていただいております。 凍結保存されている、stable cell lineを起こしたいと考えています。 細胞は293ＴおよびHepG2で、selectionに使用する抗生剤はピューロマイシンです。 最終的に使用するピューロマイシンの濃度は分かっているのですが、細胞を起こす際にピューロマイシンの添加をどうするかで迷っています。 起こした直後の細胞が弱った状態では、細胞毒性があるピューロマイシンは加えない方がいいでしょうか？ または、出来るだけ目的外の細胞が出現するリスクを下げるように、当初から低濃度でもピューロマイシンを添加しておくべきでしょうか？（また、この場合のピューロマイシンの濃度はどの程度添加するのがよいでしょうか？） 皆様が通常、どのようにされておられるのか、また参考となる情報源等もありましたら、お教えいただけましたら幸いです。 よろしくお願いいたします。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---