全22件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.2678-22 - 2013/12/23 (月) 19:31:39 - primer 直輝 様、おお様 結構かかるという印象の様ですね。 ありがとうございます。 今後の参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.2678-21 - 2013/12/23 (月) 03:09:39 - おお 例えばプラスミドのコンストラクションのとき、ここのドメインをPCRで増幅してとかなると、あまり選択の余地がないですが、PCRはかなりの確率でかかります。

(無題) 削除/引用 No.2678-20 - 2013/12/23 (月) 00:52:20 - 直輝 ヒト/マウスの共通部分にプライマーを作るときは、プライマーを作る場所があまり選べないので、下に書いた項目の一部を妥協するかもしれません。 私が妥協するとしたら ・プライマーの長さ ・GC含量 ・Tm値の差 ・プライマー3'末端のT のあたりです。

(無題) 削除/引用 No.2678-19 - 2013/12/23 (月) 00:35:02 - 直輝 私もprimer3を知ってからは自分で１から考えることはなくなりましたが、それまでは下の条件でプライマーを作っていました。 ・18〜23merぐらい ・GC含量 40〜60% ・Tm値 55〜70℃（できるだけ60〜65℃を狙う） ・２つのprimerのTm値の差は10℃以内にする（できれば5℃以内） ・増幅産物の長さは80〜200bps程度 ・3'末端５塩基中のG/Cの数は2個か3個 ・3'末端のTはできるだけ避ける ・2つのプライマーの3'末端の2,3塩基が相補的でないことを確認 ・可能であればエキソンジャクンクションを挟むように設計する （これにこだわる方も多いと思いますが、私はあまりできていません。 設計箇所が限定されすぎて、その他の条件を満たすのが苦しくなるので…） あとは、Blastで対象種（マウス/ヒトなど）を絞って特異性を検索し、3'末端が一致する配列が他に見つからなければOKとします。 この条件を満たしていればまず間違いなく増幅すると思いますが、dissociationカーブを見たときに２山（大きい山と小さい山）あれば作り直します。 成否の確率は目視でやってもprimer3やprimer blastでやっても変わりはなく、目視の方が単に時間がかかるだけという印象です。

(無題) 削除/引用 No.2678-18 - 2013/12/22 (日) 21:49:25 - primer 直輝　様 ＞1)ClustalWで共通配列を特定 2)目視でプライマーを決める 3)Primer Blastで特異性をチェック で出来ると思いますよ。 私はprimer3などで配列を出すか、 論文で使われているものと同じ配列かしか行ったことがありませんでした。 目視でプライマーを決めるとのことですが、 web等で出てくるプライマーの条件、FwとRvのTm値やGC比等、をどの程度考慮しておられるのでしょうか。 配列を見て「ここにしたい」という部分があっても、 Tm値がかけ離れているなどがあり、 これでいいものなのかと思ったりもしたもので。 実験の目的に寄るとこともあると思うので、 一概にどの程度いいかげんでも大丈夫だったとかは無理だとは思いますが、 特異性以外には、どういう点に特に注意して設計しておられますでしょうか。 また、成否の印象を伺うことはできますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2678-17 - 2013/12/20 (金) 21:32:10 - 直輝 1)ClustalWで共通配列を特定 2)目視でプライマーを決める 3)Primer Blastで特異性をチェック で出来ると思いますよ。 ハウスキーピング遺伝子とか、しょっちゅう使うプライマーがヒト/マウスで共通だったらちょっと便利かもね。

(無題) 削除/引用 No.2678-16 - 2013/12/20 (金) 17:40:57 - primer 前の投稿を打ちながら、 異種間でも使えるプライマーでなければならない系はないかと考えたのですが。 細胞Aと別の細胞Bで、どちらがmRNA Zがより多く発現しているのか、 という実験を考えました。 細胞AとBが同種の、たとえばヒト由来の細胞ならqPCRかければいいのではとおもいますが、 異種の細胞、例えばヒトとマウスなら、 両方でｍRNA　Zが増えるプライマーを使う必要が・・・ と考えてみたのですが、 オルソログにあたり同じ名前でも違う遺伝子なのだから、 この比較に意味はないような・・・ なにか独り言のようになってしまいましたが、 折角なので投稿しておきます。

(無題) 削除/引用 No.2678-15 - 2013/12/20 (金) 17:19:39 - primer Transfection様、おお様 確かに、お二人の言う通りですね。 Mol Cell Biol. 2007 Mar;27(5):1716-29. Epub 2006 Dec 18. の論文の中にhuman/mouse/rat-BBF2H7-5 (5-CCTTTCCTCTCAGAGAAGAG-3)の様に異種間で使えるようなprimerが使われていることが印象に残っていました。 そこで、これは便利ではと思い設計してみようと。 ですが、増えるのか自信がないものを使うくらいだったら、 より確実そうなものをそれぞれ使用した方が確かに安心ですね。 おお様 primer blastはprimerの配列を入力して、特異性をチェックすることにしか使ったことがありませんでした。 TS様 ＞産物の配列も一緒にしたいとか?? プライマー３って、増幅させたい領域の範囲とか、プライマーにしたい範囲とか、したくない範囲とか設定できるよね。 配列を一緒にしたいと思ったわけではなかったのですが、 プライマーのサイズ、GC比やプロダクトサイズ位しか調節できる設定としてを認識していませんでした。 あとの項目はなにかいろいろあるな、でも変にいじってうまく増えないプライマーができる可能性が上がるのも嫌だからデフォルトで行こう、 と思っていました。

(無題) 削除/引用 No.2678-14 - 2013/12/20 (金) 08:30:10 - TS ＞20merくらいは完全に一致しても、 残念ながら100mer近く完全に一致する配列はなく、 ところどころ細々とミスマッチがありました。 増幅領域にミスマッチをはさんでいても問題ないんじゃないの? 共通配列の20-22merくらいでF/Rのプライマーを作ったら。 それとも産物の配列も一緒にしたいとか?? プライマー３って、増幅させたい領域の範囲とか、プライマーにしたい範囲とか、したくない範囲とか設定できるよね。そういうのうまくつかえばできると思うんだけど。

(無題) 削除/引用 No.2678-13 - 2013/12/20 (金) 06:04:21 - おお あ、そうそう。わたしもわざわざ共通にしなくてもとおもって書こうと思ってた。

なぜ共通のプライマー? 削除/引用 No.2678-12 - 2013/12/20 (金) 01:23:20 - Transfection なぜ異種間で共通のプライマーを使う必要があるのでしょうか? qPCRに使うのであれば、増幅効率を調べるための予備実験を、それぞれの種に対して別々にすることが絶対に必要になるわけです。片方の種のデータを別の種に応用は出来ない(似たようなデータになることを期待はできるけど、別のデータになる可能性だって充分にも高いから必ず確認しなくてはならない)のだから、時間や試薬の節約になったりしません。逆に、もし片方の種で効率が悪い場合、それが妥協して作ったプライマーのせいだったかもと心配しなきゃならないのは非常に効率が悪いです。 そういう理由で、私だったら、それぞれの種に対して特異的な、ベストな増幅効率が期待できるプライマーセット二組を作ります。特別な処理をしないのであれば、プライマー1セットで3000円もしないわけだし。

(無題) 削除/引用 No.2678-11 - 2013/12/20 (金) 00:16:55 - おお 私はコンピューターに任せず、必要な部分あるいはよさそうな部分を自分でえらびプライまーを自分で設定してから、必要があれば(なくても打ち間違いとかケアレスミスをふせげるので) そう言うソフトで確認しています。目的によるので確認の際に必要なチェックポイントはそれぞれ違ってくるとおもいますが。 NCBIのprimer blastは使ってますか?もしかしたらちょっと気のきいたことをやってくれるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2678-10 - 2013/12/19 (木) 22:54:09 - primer ＞primer3に配列を作らせているのですか?それとも自分でえらんだ配列を確認しているのですか? primer3に配列を作らせています。 相同性の高い100-150mer位を吟味して、 primer3にコピペして、 primerの配列を吐き出してもらい、 でた配列の特異性をprimer blastでチェックしていました。 この方法に問題ありそうでしょうか。 また、もっと正確で効率の良い方法はございますでしょうか。 現状、完全に一致したり、５’側に１−２このミスマッチの様な配列を出してはくれないため、 あきらめて、出た配列の１つを試してみようかという気持ちになっています。

(無題) 削除/引用 No.2678-9 - 2013/12/19 (木) 22:44:25 - primer おお様、ありがとうございます。 ＞qPCRか、PCRがかかればいいのかどっちなんでしょうか。 qPCRです。SYBRを使ったreal time RT-PCRを行う予定です。 ＞混合プライまーは使うことがあります。かなり利用している人がいるのではと。特異性が落ちたりすることはあるようですが。 混合プライマーの認識がなかったので参考になります。 ありがとうございます。 ちなみに混合プライマーですが、 qPCRでも使われるのでしょうか。 私は全く見たことがなく、 google検索ではパッと見では見当たらないのですが。

(無題) 削除/引用 No.2678-8 - 2013/12/19 (木) 22:42:22 - おお primer3に配列を作らせているのですか?それとも自分でえらんだ配列を確認しているのですか?

(無題) 削除/引用 No.2678-7 - 2013/12/19 (木) 21:52:04 - おお qPCRか、PCRがかかればいいのかどっちなんでしょうか。qPCRは詳しくないのですが、配列の不一致でどれくらい効率などに影響するかなぁと、、、まあ2サイクル回せば末端プてライまーのはいれつになってしまいますが。 混合プライまーは使うことがあります。プライまーの注文の書き方にA+TをWとするとかありますよね。なのでかなり利用している人がいるのではと。 配列が異なるところにイノシンを入れる場合もありますね。特異性が落ちたりすることはあるようですが。 ミスマッチがはいるなら、なるべく真ん中から5'よりにしたいところです。2つの配列はぶらすとでも、clustalWでもいいからアライメントすると目で追っていけるので、設定しやすいですね。

(無題) 削除/引用 No.2678-6 - 2013/12/19 (木) 18:37:18 - primer TS様 ＞単純に共通配列を特定して、その領域でプライマーを作るのはダメですか。 運よく長く一致する部分があれば、Primer3を組み合わせてみたりとか。 （多分）いいとおもいます。 実際やってみていたのですが、 今回わたしの興味に対しては、 全体では88%一致するのですが、 20merくらいは完全に一致しても、 残念ながら100mer近く完全に一致する配列はなく、 ところどころ細々とミスマッチがありました。 もっと頑張って配列吟味とprimer3検索をすれば、 前に出した例よりもミスマッチの少ない（orない）配列が 運よく引っかかることもあるとは思ったのですが、 primer3は私の思ったところをターゲットとして出してくれる訳ではありませんし、 もっといい方法はないものかと思った次第です。 ClustalWは使ったことがないので、 使ってみたいと思います。 TS様、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2678-5 - 2013/12/19 (木) 17:35:22 - TS やったこともありませんが、 単純に共通配列を特定して、その領域でプライマーを作るのはダメですか。 ClustalWとかですぐにわかるし。 少なくとも一致する配列で設計はできますね。うまくかかるかはわかりませんが。 運よく長く一致する部分があれば、Primer3を組み合わせてみたりとか。 これってだめなのかな。

(無題) 削除/引用 No.2678-4 - 2013/12/19 (木) 16:04:46 - primer AP様 ＞この程度なら、不一致塩基はヒト配列、マウス配列の混合になるようにプライマーをオーダーするんじゃだめなんだろか。degenerateするのは追加料金無しだよな。 この発想はありませんでした。 論文で表記されている配列をblast検索しても完全には一致しないことがあり、 この人たちはどんなどうしてこんな配列を・・・ と思ったこともありましたが、 もしかしたらこういうことをされていたのかな。 勉強になります。 ＞ミスマッチがプライマーのどのへんにあるかとか、プライマーの長さがどれくらいでそれに対してミスマッチがいくつあるかによるけれど、 20merの配列のうち2merです。 例えばFwでは１５と１７，Rvでは８と２０塩基目のように、 あまり気にならなそうな端もあれば、 真ん中らへんもあり、 近接しているものもあり。 ＞2塩基くらいのミスマッチなら、そのままの条件、あるいはややアニール温度を下げてやるだけでPCRがかかることも多いけどな。 との経験談もあるようなので、 やってみればいいのかなとも思いました。 参考になりました。 AP様、ありがとうございます。 このほかにも設計法のご提案、ご意見、経験等、 お待ちいたしております。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2678-3 - 2013/12/19 (木) 15:30:54 - AP ミスマッチがプライマーのどのへんにあるかとか、プライマーの長さがどれくらいでそれに対してミスマッチがいくつあるかによるけれど、 2塩基くらいのミスマッチなら、そのままの条件、あるいはややアニール温度を下げてやるだけでPCRがかかることも多いけどな。

全22件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---