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(無題) 削除/引用 No.2682-10 - 2013/12/24 (火) 09:35:39 - バイオ浪漫 >[Re:9] Hajimeさんは書きました : > つねにポジティブコントロールがあったほうがFACSのOptimizeしやすいと思います。 > 目的の細胞はたとえわずかでも、血液中の他の細胞からの遺伝子X発現により最低限、お使いになられている抗原のOptimizeはできるのではないでしょうか？ Hajimeさん、コメントありがとうございます。 全くその通りで、私も常にpositive controlが欲しいと思っています。 なので、やってみる価値はあると思います。 > 私は血液を目的によりTali vein,Cheek,retro-orbitalから取っています。 > 英語でですがCheekから血液を取る動画がありました。 そんな方法があるのですね。知りませんでした。 調べてみると、この会社でランセットが売っているようですね。 http://www.brck.co.jp/product/a-2_medipoint_animallancet.html > 最終的にはBDからのBD Cytofix/CytopermとPermeabilization Buffer Plusを使い、 > Staining Intracellular Antigens for Flow Cytometry Protocol > http://www.ebioscience.com/resources/best-protocols/flow-cytometry-protocols.htm > にあるプロトコルを多少変えて実験を行いました。 有用なサイトを紹介していただいて、ありがとうございます。 まずは読んでみます。

(無題) 削除/引用 No.2682-9 - 2013/12/24 (火) 01:05:13 - Hajime 血から繰り返ししすぎるのもマウスにとっては良くないと思いますし貧血等のPhenotypeがあるのでしたらお勧めできませんが、 つねにポジティブコントロールがあったほうがFACSのOptimizeしやすいと思います。 バイオ浪漫様がお持ちのマウスで遺伝子Xが抹消血でも発現しているのであれば、 目的の細胞はたとえわずかでも、血液中の他の細胞からの遺伝子X発現により最低限、お使いになられている抗原のOptimizeはできるのではないでしょうか？ 私は血液を目的によりTali vein,Cheek,retro-orbitalから取っています。 英語でですがCheekから血液を取る動画がありました。 How to obtain blood samples from the facial vein of a mouse. http://www.youtube.com/watch?v=niTVnEAHOko 私がした時は、細胞内染色でIndirectFACSは難しかったです。 細胞をpermeabilize＆fixしてとそれぞれのステップで色々変えました。 最終的にはBDからのBD Cytofix/CytopermとPermeabilization Buffer Plusを使い、 Staining Intracellular Antigens for Flow Cytometry Protocol http://www.ebioscience.com/resources/best-protocols/flow-cytometry-protocols.htm にあるプロトコルを多少変えて実験を行いました。

(無題) 削除/引用 No.2682-8 - 2013/12/23 (月) 15:31:54 - バイオ浪漫 >[Re:7] Hajimeさんは書きました : > バイオ浪漫様のX発現マウスからの末梢血で目的遺伝子Xの発現をコントロールマウスと比べられないでしょうか？ > > それとも脾臓細胞特異で発現しているのでしょうか？ Hajimeさん、コメントありがとうございます。 貴重なマウスでは、末梢血を使えば、繰り返しFACSできるという方法は考えていませんでした。 末梢血でも目的のXは発現しているはずです。 しかし、発現していると予想される分画がわずかなため、少量の血液で検出できるかどうか、、、。少量の血液はどこから採取されていますか？眼だと、まずは自分が技術を習得することから始めないと。 これまで書き忘れていましたが、目的のXが表面抗原でないので細胞内染色をしないといけないこともFACSを難しくしている要素かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2682-7 - 2013/12/23 (月) 13:06:51 - Hajime FACSのTitrationは大変ですよね。 脾臓細胞でやられているそうですが、 バイオ浪漫様のX発現マウスからの末梢血で目的遺伝子Xの発現をコントロールマウスと比べられないでしょうか？ それとも脾臓細胞特異で発現しているのでしょうか？ 私は希少なマウスでのFACSをOptimizeするときに血を使い試しました。 実際にお使いになられている一次抗体がX発現マウスででもあまり陽性にならないかもしれません。 私はそうだったので一次抗体のクローンを変えました。 もちろんSpleenとはTitrationが違うかもしれませんが、参考になるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2682-6 - 2013/12/22 (日) 18:32:29 - バイオ浪漫 >[Re:5] おおさんは書きました : > もし発現しているマウスで、発現していないマウスの10倍ぐらいのシグナルがあれば、カットオフを、そのバックグランドより上に設定すればいいわけですよね、、、 > > 抗体の濃度下げてみます? あと参考程度の情報として、WBではのんすぺが見えるかどうか。 ありがとうございます。 結構なシグナル強度で見えていたので、抗体濃度を下げることは必要かもしれません。カットオフが出せるほどシグナルが違うといいのですが。。。 あとは、Xの分子量は既知なので、WBで確認することも一法ですね。 とりあえず今、考えているのは、マウスIgG1である一次抗体で染める前に、抗CD16/CD32抗体によるブロッキングに加えて、未標識マウスIgG Fabフラグメントでブロッキングすることで、このノンスペ（？）が消えてくれないかと思っています。結局、一次抗体がマウス細胞に非特異的にくっついていることを想定しているのですが、、、どうでしょうか？ 基本的なことを知らないのですが、Fabフラグメントであっても、二次抗体（anti-mouse IgG1 antibody）は結合して、シグナルが見えてしまうのでしょうか？ ご意見お待ちしています。

(無題) 削除/引用 No.2682-5 - 2013/12/22 (日) 15:16:46 - おお もし発現しているマウスで、発現していないマウスの10倍ぐらいのシグナルがあれば、カットオフを、そのバックグランドより上に設定すればいいわけですよね、、、 抗体の濃度下げてみます? あと参考程度の情報として、WBではのんすぺが見えるかどうか。

(無題) 削除/引用 No.2682-4 - 2013/12/22 (日) 14:31:46 - バイオ浪漫 おおさん、コメントありがとうございます。 >[Re:3] おおさんは書きました : > xはマウスのゲノムには無い遺伝子でしょうか? Xはマウスのゲノム上にはありませんし、類似の遺伝子もありません。 一次抗体（モノクローナル抗体）のエピトープが不明なので、何とも言えませんが、Xを発現しないマウスに特異的に反応してしまうことはないと思っています。 >[Re:2] おおさんは書きました : > 発現している細胞と比べてシグナルはどの程度の強度でしょうか。 これなんですが、実験時のマウスの取り違えで結局、見れていません。 まだXを発現するマウスが貴重なので、まずはXを発現していないマウスでは陽性と見える細胞が検出されない条件を見つけてから、X発現マウスを使おうと考えています。

(無題) 削除/引用 No.2682-3 - 2013/12/22 (日) 14:01:21 - おお xはマウスのゲノムには無い遺伝子でしょうか?

(無題) 削除/引用 No.2682-2 - 2013/12/22 (日) 13:59:54 - おお 発現している細胞と比べてシグナルはどの程度の強度でしょうか。

マウス細胞にマウス一次抗体のFACS 削除/引用 No.2682-1 - 2013/12/22 (日) 13:48:43 - バイオ浪漫 お世話になります 今、ある遺伝子Xを発現させたマウスを飼育しています。そのマウスからXを発現する細胞を含む脾臓細胞を単離して、Xが発現していることを確認するためのFACSを実施しようと試みています。 手持ちの一次抗体は未標識のマウス抗X抗体（IgG1）しかなかったので、二次抗体に蛍光標識したanti-mouse IgG1 antibodyを使用してみました。一次抗体の染色前に抗CD16/CD32抗体によるFcレセプターのblockingを実施して、一次抗体と二次抗体の両方で染めた場合、と二次抗体のみで染めた場合を見てみました。その結果、Xを発現していないはずのマウスの細胞で一次抗体と二次抗体を反応させるとX陽性とみえてしまう細胞群が現れ、二次抗体のみではこの細胞群は認められませんでした。 今、このバックグラウンドと思われるものを消したいと思っているのですが、 どのように対処したらよろしいでしょうか？ ちなみにこの一次抗体がXを発現するヒト細胞に対しては問題なくworkしています。

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