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(無題) 削除/引用 No.2731-17 - 2014/01/20 (月) 22:58:17 - 名無し じゃあれか、その物質に対する抗体でIPして、その物質にいっしょにくっついてきたものを同定しましょうみたいな感じか？なら電気泳動とかわざわざ必要ないと思うんだが。ていうか、普通しないわな。IP物を抗体ビーズからUreaとかみたく、MS分析で差し障りないもので溶出(SDSあれはだめだよ）還元アルキル化してウレア薄めてからトリプシン入れて溶液内消化してLC-MS/MSにgo, みたいな流れかな。そうすればとりあえず、IPで釣ってきたもののなかに何があるかはわかる。溶出以降の処理は、分析する人に相談してどういうふうにすれば一番いいか聞いてやればいいていうかやってくれるかもしれないけど。 電気泳動／ゲル内消化すると、（ただでさえ少ない）ペプチドの回収率も下がるし、ケラチンとかゲル由来のコンタミナントがたくさん入ってきて、BGが上がり、同定の精度も下がる。とくに微量の場合はこれらは成否に大きく影響するとおもう。本来はnormal IgG-beadsでも並行してIPして、どちらでも検出されたものは一応BGと考え、Ab-beadsの方だけで検出されたものを本物ととりあえず判断し、確認として、immuno pull downとかで検証みたいな感じかな。理想的には安定同位体アミノ酸標識で定量プロテオミクス的にやれば一番いいんだが。

(無題) 削除/引用 No.2731-16 - 2014/01/20 (月) 13:42:11 - 免疫屋 名無しさん おおさん ご意見ありがとうございます。 そうですね、コンタミやノンスペの影響が大きくなることは否めないので、その点は承知しています。 まず非常に少ない細胞のさらにその分化過程の特定時期のみを対象としていまして、確保できる細胞数がかなり限られるという状況にあります。また、一細胞あたりほんのわずかしか存在しない、とある物質にアソシエイトしているタンパク質をスクリーニングしたいと考えている状況でして、マスに供するサンプルは極小量となることが想定されました。 とにかく複数回の検討や適切なコントロールの設定にてコンタミノンスペの影響を少しでも減らし、その中で得られたタンパクリストからのcandidateをKO/KD/生化学的なアッセイにて再度スクリーニングし、重要因子を見いだして行くというアプローチを考えています。マス解析はあくまで候補因子の選定としての利用となりまして、そこで得られたプロファイルを元になにかを論じようとは考えておりません。ですので、コンタミやノンスペに埋もれる形で確認されたわずかなピークであっても面白そうなら解析対象に抽出するといった形を想定しています。 まぁ、やってみてダメだったら再考という形も考えられるのですが、今回の実験を実施するにあたってトランスジェニックマウスの樹立が必要となる状況でもありまして、ある程度マス解析の目処がたたないと先へ進めづらいなと思っているところです。 いろいろなご意見ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2731-15 - 2014/01/19 (日) 08:56:51 - おお マスの実際のシーケンスデーターを見るとかなりノンすぺのピークが出ていてその中からあり得そうなのを拾っている感じがします。微量になるほどノンすぺのピークがめだって、そちらの方にあわせた解釈になりがちかなぁというのはありますねぇ。。。シーケンスまでせずに、データーベースにペプチドマスを当てるという方法なら、、、、とか、、、でもちょっと具体的にはわかりません。

(無題) 削除/引用 No.2731-14 - 2014/01/18 (土) 01:41:15 - 名無し こっち系の分野じゃないのと、実験目的の具体的なことがよくわかんないんであれなわけだが一応書く。あんまり微量だと、MSデータは何か出るだろうけど、コンタミナントの影響がその解析にかなりひびいてきちゃんうんじゃね。ていうかコンタミのケラチンとかそういうのよりも少なかったらやっぱどれが目指す蛋白質なのかもあやしくなってくるんじゃねとかが心配。定量的プロテオミクスやって、コンタミやバックグラウンドと目指すものとを識別できればなんとかなるかもしれないけど。 IPとかである程度まで精製した特定の蛋白質を調べるのかな。それとも安定同位体標識とか組み合わせて、細胞内蛋白質全体で網羅的に増減の比較とかやるのかな。それにもよると思う。 外部委託するにしても、分析する方ともそういう情報を互いに共有して、事前によくうちあわせたほうがいいんじゃね。専門家動員して上位機種つかえばなんとかなるというもんじゃないみたいな気するし。ていうかどういう理由で量を確保（精製や濃縮） できないのかな。

(無題) 削除/引用 No.2731-13 - 2014/01/17 (金) 14:48:01 - 免疫屋 greenさん 再度のコメントありがとうございます。 たぶんfgのオーダーでしか確保できない気がします。これもまたやってみないとわからないといったところで…。 やはり難しいかな。 もちろん別の手も考えていますが…。

(無題) 削除/引用 No.2731-12 - 2014/01/17 (金) 12:22:00 - green 免疫屋さん 0,5ngあれば何とかなりますよ。 最新の物なら、もっと少量も可能かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2731-11 - 2014/01/17 (金) 11:06:09 - 免疫屋 greenさん 情報のご提供ありがとうございます。 とても銀染で染められる量を確保できるとは思えないので悩んでいまして、現在、微量タンパク質をゲル分離しないでショットガン解析にもっていけないか思案中です。また、（スクリーニング目的のため）定量的に解析することもとりあえず欲してはいないので、サンプル中のタンパク質リストを部分的にでも定性的に得られたら御の字と思っています。もちろんコンタミなどの影響がより大きくでること間違いないので、複数回の検討を通して共通する存在タンパク質候補が得られたらという認識です。 その後アトモルレベルのタンパク質を解析可能とのお話は確認したのですが、やってみないとわかりませんが、分子数として1アトモル集めるのも大変かも…。というところで悩み中です。

(無題) 削除/引用 No.2731-10 - 2014/01/16 (木) 14:49:05 - green 他社のものは分りませんが、近年のLTQ Orbitrap系ならば、銀染で見えれば(見えなければ切り出せないので)、１バンドから同定できます。微量の時は銀染よりは、蛍光染色試薬を使った方が良いです。

情報ありがとうございます 削除/引用 No.2731-9 - 2014/01/15 (水) 19:07:30 - 免疫屋 おおさん 中西部ポスドクさん emaさん ご回答ありがとうございました。 お礼が遅れて申し訳ありません。まだ本トピックを終了とはせず引き続き情報のご提供を待ちたいとは思いますが、頂いた情報や方策を参考に検討を進めたいと思っています。 ありがとうございました。

共同研究とか考えてるなら 削除/引用 No.2731-8 - 2014/01/15 (水) 13:41:35 - ema 鶴岡の慶應義塾大学先端生命科学研究所(Institute for Advanced Biosciences, IAB)は結構いいかと思います。 http://www.iab.keio.ac.jp/jp/component/option,com_frontpage/Itemid,1/

(無題) 削除/引用 No.2731-7 - 2014/01/15 (水) 06:48:04 - 中西部ポスドク http://www.molprof.jp/about/index.html 夏目徹先生が詳しかったように思います。 後は以前金沢八景あたりにあったキリンの社内ベンチャーから独立された方がMALDI-TOFに関しては絶大な信頼があったのですが、連絡先を失念していまいました。

(無題) 削除/引用 No.2731-6 - 2014/01/15 (水) 03:55:16 - おお http://www.mssj.jp/ 学会から情報を得るというのもてかもしれませんね。抄録とか手に入れば、どんな材料で、どんなマシンをつかいどんな解析をしているかわかりますし。

(無題) 削除/引用 No.2731-5 - 2014/01/14 (火) 16:54:07 - 免疫屋 おおさん 早速のご回答ありがとうございます。 受託解析を行っている企業のサンプル条件として「CBBでバンドが判断可能」とか「銀染色バンド何本」といった確実に同定可能かと考えられる条件を提示しているものがほとんどだったので、最初から対象外と考えていましたが、確かに裏で高感度化を模索していたり、情報を有しているということもあるかもしれませんね。確認してみます。 質量分析の改良を目的としている教室としては、例えば理研QBiCの一細胞質量分析研究チームさんなどのような研究室がありました（こちらは主にメタボライトの解析のようですので今回のご相談の対象外とは思っています）。タンパク質解析にも同じように尖った技術開発を目論んでいる教室/企業があるんじゃないかと思いまして、そのような教室の情報を頂けたらと思っています。相談や共同研究など打診させて頂きたく思っているところです。 このような教室/企業の情報をお伺いできれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2731-2 - 2014/01/14 (火) 16:22:08 - おお どうでしょう、、、MSを実際に売っている会社とか、、、島津とか、、、サンプル解析のサービスがあるなら早いかもしれませんし、なくても相談次第でやってくれるかもしれませんし、納入先の情報とか(納入先の了承をえてから)教えてくれるとかあるかもしれません。。。納入先などであればそちらに出入りしている代理店も把握している可能性はありますね。

高感度LC-MS/MS 削除/引用 No.2731-1 - 2014/01/14 (火) 16:05:11 - 免疫屋 いつもお世話になっております。 タンパク質同定に質量分析の適用を予定しています。 銀染色→切り出し消化→LC-MS/MSなどの形では学内のファシリティで十分対応できたのですが、現在解析を予定しているサンプルでは用意できるタンパク質量がものすごく少ないことが予想され、常法での同定が困難かと考えています。 そこで質量分析の高感度化を目標としている教室や企業、あるいは微量サンプルの解析に習熟した方々に当方のプランにて解析が可能か相談したく思っておりまして、そのような教室/企業の情報を集めているところです。 質量分析の高感度化に取り組んでいる教室や企業、微量サンプルの解析に長けている教室や企業の情報をお持ちでしたら、こちらにご紹介いただけましたら幸いに存じます。国内•国外問いませんので、なにかご存知の情報がありましたらご教示ください。 以上、よろしくお願い致します。

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