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(無題) 削除/引用 No.2738-14 - 2014/01/30 (木) 18:41:24 - としょ >[Re:13] Gさんは書きました : > エンドソームやファゴソームの中は酸性で、GFPは酸性で蛍光強度が下がりますが、固定してからFACSしてますか？生きたまましていますか？ > 私はバクテリアに単コピーでGFPを弱く発現させてます。バクテリア１細胞でも測れるのですが、マクローファージなどに取り込ませると、明らかに蛍光が弱くなります。ご参考まで。 生きたまましています。酸性で蛍光強度が下がっていくのはGFPだけでなく、PEなど他の蛍光色素でも見られることなのでしょうか？これはタンパク質、あるいは蛍光色素がリソソーム酵素によって分解されることによるものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2738-13 - 2014/01/22 (水) 11:21:00 - G エンドソームやファゴソームの中は酸性で、GFPは酸性で蛍光強度が下がりますが、固定してからFACSしてますか？生きたまましていますか？ 私はバクテリアに単コピーでGFPを弱く発現させてます。バクテリア１細胞でも測れるのですが、マクローファージなどに取り込ませると、明らかに蛍光が弱くなります。ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.2738-12 - 2014/01/19 (日) 06:31:08 - おお CFUで得られたバクテリアはすべて同じぐらいの蛍光強度で光るでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2738-11 - 2014/01/18 (土) 20:33:48 - Harmonia じゃあ、CFUを測定すると1000程度差があるバクテリアを使って、蛍光強度を みるとどうなりますか？ 「計測系がそうだからそうなる」というオチがこわい。

(無題) 削除/引用 No.2738-10 - 2014/01/18 (土) 17:25:09 - おお 細胞表面についているものがどの程度除けているかという点で、両者の方法をの違いをくらべて、差が出そうなところはないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2738-9 - 2014/01/17 (金) 12:56:46 - りこう >[Re:8] 独り言さんは書きました : > FACSのほうが検出感度が悪いからではないでしょうか？そもそもそのGFPバクテリア１つを測定できている感度なんですか？ > > 例えば、取り込み直後は１細胞あたり1-100個程度のバクテリアが入っているが、FSCSでは50個以上入っていないと検出できない。その後、１細胞あたり1000-100000個ぐらいに増えたから検出できるけど、そもそも1000個以上の蛍光はサチレーションしていて、正確な蛍光強度になっていないとか。 > サチュレーションという可能性もあるかもしれませんが、それでも1000倍と2倍とではいくらなんでも違いすぎるように思うのですが。。すみません、でも確かに、GFPバクテリアの１つを測定できるほどの感度はもっていないとは思います。 >[Re:7] cDNAさんは書きました : > GFPが蛍光を持つには酸素が必要ですが、バクテリアへの酸素供給に差は無いでしょうか。 FACSに用いた菌は培養細部内でかっているのでCO2incubator内で生育したものですが、CFU assayの菌はプレートにまいてふつうの37℃ incubatorないで生育したものです。なので、酸素量としてはどちらも同じものだと思います。 >[Re:5] おおさんは書きました : > GFPをつけたバクテリアと書いていますが、具体的にはどの様な操作でGFP蛍光活性をバクテリアに持たせたのでしょうか? 他の研究室から分与された菌なので、正確かどうか分かりませんが、gfpのcDNAが載ったシャトルベクターを目的のバクテリアに導入してつくったようです。

(無題) 削除/引用 No.2738-8 - 2014/01/16 (木) 20:31:34 - 独り言 FACSのほうが検出感度が悪いからではないでしょうか？そもそもそのGFPバクテリア１つを測定できている感度なんですか？ 例えば、取り込み直後は１細胞あたり1-100個程度のバクテリアが入っているが、FSCSでは50個以上入っていないと検出できない。その後、１細胞あたり1000-100000個ぐらいに増えたから検出できるけど、そもそも1000個以上の蛍光はサチレーションしていて、正確な蛍光強度になっていないとか。

(無題) 削除/引用 No.2738-7 - 2014/01/16 (木) 18:23:22 - cDNA GFPが蛍光を持つには酸素が必要ですが、バクテリアへの酸素供給に差は無いでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2738-6 - 2014/01/16 (木) 16:45:45 - st >これは、取り込んだ時には2倍程度しか差はなかったが、そのうちコロニーを形成するほど生きのいいバクテリアはどれくらいかという点で見ると1000倍程度の差があったという解釈でよろしいのでしょうか。 野生型の値がそれぞれノックアウトの2倍と1000倍として， GFPの分解の違いを無視すると，上記の解釈でいいような気がします。 でも，バクテリアのダメージがノックアウトが非常に大きいというような感じがします。

(無題) 削除/引用 No.2738-5 - 2014/01/16 (木) 15:27:53 - おお GFPをつけたバクテリアと書いていますが、具体的にはどの様な操作でGFP蛍光活性をバクテリアに持たせたのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.2738-4 - 2014/01/16 (木) 15:00:13 - りこう >[Re:2] おおさんは書きました : > 細胞に感染させた早い段階でMFIをみてるなら、取り込み効率を見ている可能性もありますし、、、 仰る通りで、取り込み効率を見ているのですが、1000倍量多く取り込んでいるのにMFIが2倍程度しか差がないというのはどういうことなんだろうと思っているわけです。。。

(無題) 削除/引用 No.2738-3 - 2014/01/16 (木) 13:44:34 - TK-1 自分の書いた文章をもう一度読み直して、他の人が理解できる文章になっているか確認してください。

(無題) 削除/引用 No.2738-2 - 2014/01/16 (木) 13:42:13 - おお まあ死んでいても、バクテリア内のGFPの分解が進んでなければ、蛍光ではカウントされますよね。 細胞に感染させた早い段階でMFIをみてるなら、取り込み効率を見ている可能性もありますし、、、

CFUとMFIの測定の差について 削除/引用 No.2738-1 - 2014/01/16 (木) 11:34:43 - りこう いつもお世話になっております。 GFPをつけたバクテリアを野生型とノックアウトのマウス細胞にそれぞれ取り込ませて、1時間後、そのバクテリアを取り出し、プレートにまいて4週間後にCFUを測定すると1000程度あったのですが、取り込ませて1時間後のGFPの蛍光強度（MFI)をFACSでみると2倍程度しか差がありませんでした。これは、取り込んだ時には2倍程度しか差はなかったが、そのうちコロニーを形成するほど生きのいいバクテリアはどれくらいかという点で見ると1000倍程度の差があったという解釈でよろしいのでしょうか。

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