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santa cruz Wee1抗体の透過処理について トピック削除
No.2753-TOPIC - 2014/01/21 (火) 15:01:08 - assu
いつも拝見させていただいています。
最近マウスE10.5日〜12.5日胚で免疫染色を始めました。
ターゲットは細胞周期関連タンパクです。
santa cruzのWee1抗体（sc-325）を購入しまして早速免染をしてみたのですが、染まりがイマイチでした。
プロトコルは以下に示します。

・10％TCAで20min氷上固定
・0.1%Triton/PBSで5min×3times wash
・FBSを1%Triton/PBSで10%とし、それでブロッキング
・一次抗体添加、o/n
・wash
・二次抗体添加、2hr
・観察

といった具合です。
抗体の濃度は添付資料に記載されている最低濃度（50倍希釈）から割り振って行いましたが、50倍希釈でも染まりが悪いです。
そこで、参考文献通りの手順で行うこととしました（参考文献はマウス胚の細胞ではない）。
大きな違いは透過処理を単独でしているかだけです。
上記の私が試したプロトコルではブロッキング中に透過処理を行っています。
参考文献には0.2％Triton/PBSで透過処理と書いてありますが、時間が記載されていません…
本来なら15〜30minが妥当だと思うのですが、それなら私が試したプロトコルの方が透過処理をしっかりしているように思います（1％Tritonですので）。

M1なものでまだまだ経験が足りなく、皆様のお力をお借りしたいと思います。
よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.2753-7 - 2014/01/22 (水) 21:42:37 - う
サンプルは培養細胞？？
胚じゃなかったの？

染色がうまくいっていないのに、
固定方法はTCAが最適っていう
根拠が私には理解できません。

(無題) 削除/引用
No.2753-6 - 2014/01/21 (火) 18:07:47 - qq
the human protein atlasを見てみると、wee1の組織分布はかなり特異的（胎盤と胆嚢）なようです。コントロールを用意する意味からも、見てみられてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.2753-5 - 2014/01/21 (火) 17:25:47 - おお
検出は蛍光ですか?それとも発色ですか?プロとコールをみるとどうも抗体の透過が問題のように見えませんけど、、、

固定方法も探ってみるといいと私も思いますが、triton をtweenに変えてみてもいいかも。

>FBSを1%Triton/PBSで10%
1%もtritonが必要なんでしょうか。かえって抗原を洗い落としているようなきがします。TCAで固定してますので、クロスリンクされてませんし。。。

(無題) 削除/引用
No.2753-4 - 2014/01/21 (火) 17:22:44 - assu
ななしさん

お返事ありがとうございます。
sampleは培養細胞です。
固定方法は参考文献では10%TCAと記載されていました。
10%TCAと4%PFA、どちらでも試し、固定方法は10%TCAの方が良いとの結論を出しています。

加熱処理の件ですが、確かにWBに多く使われています。
そのため免疫染色を行っている文献が少なく困っていました。
なので、加熱処理を試してみたいと思います。

二次抗体のミスは確認しましたが無さそうです。
ななしさんのおっしゃる通りPCを取るべきでした…

ご指摘、アドバイスありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.2753-3 - 2014/01/21 (火) 16:35:42 - ななし
ホールマウントですか？　組織切片ですか？

透過処理の検討も大事ですが、固定方法の検討も大事です。

ウエスタンなどに良く使われる抗体でしたら、加熱処理を行うと良く染まる場合もあります。
ナカライから出ているHisto VT One のような賦活化試薬もありますので、担当教員と相談してみるといいと思います。

良くあるミスとしては、二次抗体に対して、蛍光顕微鏡の波長が合っていないことがあります。

いずれにしても文献を参考に、必ず染まるポジティブコンロールが欲しいです。

santa cruz Wee1抗体の透過処理について 削除/引用
No.2753-1 - 2014/01/21 (火) 15:01:08 - assu
いつも拝見させていただいています。
最近マウスE10.5日〜12.5日胚で免疫染色を始めました。
ターゲットは細胞周期関連タンパクです。
santa cruzのWee1抗体（sc-325）を購入しまして早速免染をしてみたのですが、染まりがイマイチでした。
プロトコルは以下に示します。

・10％TCAで20min氷上固定
・0.1%Triton/PBSで5min×3times wash
・FBSを1%Triton/PBSで10%とし、それでブロッキング
・一次抗体添加、o/n
・wash
・二次抗体添加、2hr
・観察

といった具合です。
抗体の濃度は添付資料に記載されている最低濃度（50倍希釈）から割り振って行いましたが、50倍希釈でも染まりが悪いです。
そこで、参考文献通りの手順で行うこととしました（参考文献はマウス胚の細胞ではない）。
大きな違いは透過処理を単独でしているかだけです。
上記の私が試したプロトコルではブロッキング中に透過処理を行っています。
参考文献には0.2％Triton/PBSで透過処理と書いてありますが、時間が記載されていません…
本来なら15〜30minが妥当だと思うのですが、それなら私が試したプロトコルの方が透過処理をしっかりしているように思います（1％Tritonですので）。

M1なものでまだまだ経験が足りなく、皆様のお力をお借りしたいと思います。
よろしくお願いいたします。
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