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(無題) 削除/引用 No.2754-9 - 2014/01/25 (土) 07:01:59 - んgs データ次第で、そのサンプルを使ってMeDIP-seqをする予定であればともかく、正確にメチレーション程度を測りたいのであれば、BS-PCRの方が良いと思います。シークエンスコストはかかりますが。mDIPの条件検討など、１から始めるのも面倒ですし。

DNAメチル化のreal-time PCRによる定量的解析 削除/引用 No.2754-8 - 2014/01/24 (金) 16:33:03 - kifurukawajpn そうか、完全メチル化と完全非メチル化の標準DNA（市販していたはず）をinputして、 内部標準にすればいいということですね。 その線で検討してみます。 皆さん、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2754-7 - 2014/01/24 (金) 16:11:45 - おお 一般的にどの様なアプローチをしているか調べて、それに従うか近いやり方にするのがいいかと思いますが、わたしはそう言う文献は詳しく見たわけでないので方法論に関して、こういうふうにしているというのはできません。 可能性として一案出しておきますと、得られたDNA断片にメチルかされた合成DNAとか、完全にメチル化されているとわかったDNAを混ぜます。ゲノム一コピーに相当するぐらいの量です。 混ぜた段階であなたのターゲットと、加えたメチルかDNAをqPCRします。これで比がサイクル数の差としてでてきますよね。 次にメチルかDNAを回収します。ターゲットが完全にメチル化されていれば比は変わらないはず。あるいは5-Aza-cytidine処理、未処理でメチルかDNA回収前にターゲットと加えたメチルかDNAのqPCR比が変わらないようにしてから、メチルかDNAを回収する。回収後の加えたメチルかDNAとあなたのターゲットの比を5-Aza-cytidine処理、未処理で比較する。 うまくいくか、通用する方法かはちょっとわかりません。

DNAメチル化のreal-time PCRによる定量的解析 削除/引用 No.2754-6 - 2014/01/24 (金) 14:36:51 - kifurukawajpn > 実験の流れは変えられないのでしょうか？ 絶対定量法ではダメなのでしょうか？ DNAの断片化、メチル化DNAの結合蛋白をくっつけたビーズへの結合によるメチル化と非メチル化DNAの分離というステップを経ます。 その分離したDNA断片を鋳型にしてPCRをするので、PCRのデータ再現性そのものはPCRの回数を重ねれば収斂するとして、 サンプルごとの回収率とかが正確に見込めていないので、果たして絶対定量法に妥当性があるのかどうか自信が無いのです。 なので、内部標準が取れればと思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.2754-5 - 2014/01/24 (金) 13:19:44 - s 実験の流れは変えられないのでしょうか？ 絶対定量法ではダメなのでしょうか？

DNAメチル化のreal-time PCRによる定量的解析 削除/引用 No.2754-3 - 2014/01/24 (金) 13:02:16 - kifurukawajpn > 次世代シーケンサーとか？ 先立つものが (^_^;)

(無題) 削除/引用 No.2754-2 - 2014/01/24 (金) 11:09:21 - てきとう 次世代シーケンサーとか？

DNAメチル化のreal-time PCRによる定量的解析 削除/引用 No.2754-1 - 2014/01/22 (水) 14:37:26 - kifurukawajpn 転写調節領域のメチル化の程度を定量的に解析することを 考えています。実験の流れは、 １）5-Aza-cytidine処理で、脱メチル化処理した細胞と 　　してない細胞から、それぞれゲノムDNAを抽出します。 ２）そのゲノムDNAをDNaseで1000ｂｐ程度の長さに切断します。 ３）メチル化DNA結合蛋白を結合させたビーズで、メチル化DNAを 　　回収して、それを鋳型に、興味ある遺伝子の転写調節領域の 　　PCR増幅を調べる となります。 そこで、問題は、その場合の内部標準を何にするかという問題です。 もちろんDNase処理するゲノムDNAは濃度を揃えているので、 そのままPCR産物の量の比較で増減を議論してもいいのかもしれませんが、 一般のreal-time PCRのように（�刧僂t法）、例えばGAPDHや β-actinを内部標準に取って、相対的に目的の遺伝子の定量したほうが より正確なようにも思います。 しかし、GAPDHやβ-actinの方も脱メチル化すると大きく変化してしまいます。 なにかいい定量の方法がないでしょうか？

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