全19件 ( 1 〜 19 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2765-20 - 2017/05/05 (金) 11:40:35 - mon ものの本で、産業用には100-200クローン調べて、発現量が多く、かつそれが安定したクローンを選抜すると読んだことがあります。 クローン間でどれくらいの差違があるのかは知りません。。

(無題) 削除/引用 No.2765-19 - 2017/05/04 (木) 17:06:43 - おお 五、六個ひろって一つだけ５倍とか極端に高発現なものがあったりとかするなら、そういうクローンは信用しません。ミューテーションなどが入っている可能性があるので。 あとはどれくらいの精度で発現量を確認していて、その精度でどれくらいの違いが認識できるのかという点はどのように加味しているでしょうか？

タンパク質発現 削除/引用 No.2765-18 - 2017/05/04 (木) 13:52:16 - なぞ 現在、大腸菌で組み換えタンパク質の発現を試みています。 周りに経験者があまりいないのですが、コロニーにより発現量が明らかに違うということを感じたことがある方はいらっしゃいますか。

大腸菌のレアコドンを含むのでは？ 削除/引用 No.2765-17 - 2014/01/31 (金) 08:40:23 - オリゴ屋さん この遺伝子のDNA配列に、大腸菌でほとんど使われていないレアコドンを含んでいて、それが理由でタンパク発現量が低いという可能性は無いですか？ もしそうであれば、人工遺伝子合成でアミノ酸配列を変えずに、DNA配列を改変して、再トライしてみるのはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2765-16 - 2014/01/28 (火) 19:44:16 - May mRNAの高次構造さん、おおさん、そしてqqさん、 参考ご意見、本当にありがとうございます。 おおかた、翻訳が問題になっている可能性が高いということで理解しました。 みなさんのご意見を参考にして、もうすこし実験してみます。 本当にありがとうございました。May

(無題) 削除/引用 No.2765-15 - 2014/01/28 (火) 09:33:28 - qq 大腸菌（？）でTrpオペロンの古典的な制御にattenuationと言う仕組みがあります。それは転写と翻訳が同時に進んで（原核では普通の事）、翻訳初期の翻訳速度が一過性に低下すると、正しい転写に導くというものです。（詳細はご自身で確認してください。） このような事、もしくはその逆（翻訳速度の低下が誤った転写終結に導く）ようなことが起こっているのかもしれません。まあ、ここに出されている状況証拠だけでは何も判んないけどね。 感想としては、「よく発現するタグを見つけられて良かったね」と、いうところです。

(無題) 削除/引用 No.2765-14 - 2014/01/28 (火) 02:20:03 - おお 配列が違うところはHisと目的蛋白のジャンクションの部分なので、少しスペーサーをいれるとかちょっといじるとRNAの問題であれば解決するかもしれません。もちろんすでに指摘があるようにそのHisとあなたの蛋白のタグの部分を同じ長さだけどtagとして認識されない配列(同じアミノ酸を持つが配列をすくらんぶるさせたものとか、アミノ酸配列がリバースになっているものとか)を使うのも手かと。 わたしも転写よりも転写より後のステップの問題だろうなあと完全に否定できないながらも漠然におもいます。

(無題) 削除/引用 No.2765-13 - 2014/01/27 (月) 23:25:59 - mRNAの高次構造 mRNAの高次構造が、そのタグつきだと、タグなしよりも何らかの理由で翻訳効率が高いということかもしれません。No.2765-9 - 2014/01/26 (日) 11:10:54 - monさんの言われることに少々関係します。T7なら転写レベルの可能性は低い。 そのタグを多少変異させてみる（タグの意味がないほどに）、とかの対処法が考えられます。この辺は経験的なものが多いですから、あまり答えられる人はいないと思いますよ。現実的に対応しましょう。

(無題) 削除/引用 No.2765-12 - 2014/01/27 (月) 21:36:07 - May いろいろと参考意見、本当にありがとうございます。 また、文章が稚拙なため、みなさんを混乱させてしまってすいません。 まず、2つのタンパク質を発現させました。 ひとつはHis-目的タンパク質で、もうひとつはHis-別のタグ-目的タンパク質です。 ですので、スタートコドンおよびその上流そしてすぐ下流のHis配列はまったく一緒です。 C末にS-tagはつかないように目的タンパク質にはストップコドンがついています。 この2つで明らかに発現に違いがあることに困っています。 おおさんが言われているように、もし激しく分解されるなら、何かしらの分解産物が見えてもよさそうなのですが、それが一切見えないです（CBBでもHisのWesternでも）。 そのため、転写の違いが一番強いと思うのですが、この”別のタグ”をいれるだけで、なぜその発現が改善されたのかがわからなくて質問させていただきました。 どちらかというと、この”His-別のタグ-目的タンパク質”が本来の発現で、”His-目的タンパク質”の発現が異常に弱いというのが正しいところだと思います。 もしないか思い当たることがありましたらぜひ教えてください。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2765-11 - 2014/01/27 (月) 16:39:31 - おお まあよくわかりませんが、スタートこどん前後の配列が一緒ということなら、同程度発現するけど一方は壊されやすいというのは可能性としてあると思いますが、そんな激しく壊されているなら、分解産物がけっこう見られてもおかしくないかもともおもえます。なので、翻訳効率かRNAの安定性からくるんじゃないかなぁと勘ぐったりしますが、それも単なる想像といわれれば、何ら反論はできません。

(無題) 削除/引用 No.2765-10 - 2014/01/27 (月) 10:16:12 - qq ＞このタンパク質がタグつきで発現させたものも同時に行って、 ＞CBBとWesternをしましたが、このタグつきタンパク質は大変 ＞よく発現しましたが、タグなしはWesternでかろうじて見えるほどです。 で、あなたの言っている大変良く発現したタグつきは、 Hisx6-[ORF]-Stag-stop のことなのですか？どうみてもタグ付きだよねえ？ ＞すべてのタンパク質はHisタグがN末についています。 それとも、これはタグ無しでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.2765-9 - 2014/01/26 (日) 11:10:54 - mon あと、思いつくのは... SD配列〜fMETコドン付近が、他の転写領域と相補的ですと、RNAが2重鎖になり翻訳（開始）効率が大幅に低下する現象でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2765-8 - 2014/01/25 (土) 21:35:39 - May monさん、 返信ありがとうございます。 詳しく記載していませんでしたが、すべてのタンパク質はHisタグがN末についています。 その後に目的たんぱく質が発現するようになっています。 このため、N末の配列はすべてのタンパク質で同じになっています。

(無題) 削除/引用 No.2765-7 - 2014/01/25 (土) 21:33:39 - May qqさん、 これはpETDuet1で、もともとHisタグがついています。 2つのタンパク質を発現させるためのベクターですが、今回は一つ目のMCSにあるBamHIと2つ目のMCSにあるXhoIを使ってクローニングしているため、ひとつのタンパク質のみの発現ベクターになっています。 今まで、いくつかのタンパク質を同様にクローニングして問題なく発現していました。 私もタンパク質合成不全の方を疑っているのですが、こういうことは頻繁に起こりうるのでしょうか？ 今までいくつものタンパク質を発現させて初めての経験ですので。 また、His−目的タンパク質は発現が弱いのに対して、His-別のタグー目的タンパク質はCBBでくっきりと見えるほど（おそらく全タンパク質の30％ほど）発現しています。

(無題) 削除/引用 No.2765-6 - 2014/01/25 (土) 21:28:17 - May おおさん、 このベクターではHisタグがついています。 Hisのあとに目的のタンパク質をつけて発現させようとしています。 また、もうひとつのタグ付タンパク質というのは、このHisタグと目的タンパク質の間に別のタグが入っています。 これはよく発現します。

N-end rule? 削除/引用 No.2765-5 - 2014/01/25 (土) 19:31:31 - mon タグがN末なら、もしかしたら、N-end ruleが関与するかも。 http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/protein_expression/ecoli/improving_protein_stability/ N-end rule. In E. coli N-terminal Arg, Lys, Leu, Phe, Tyr, and Trp residues greatly decrease the half-life of the protein. A test protein with these residues in the N-terminal position showed half-lifes of only 2 minutes compared to more than 10 hours with all other amino acids (except proline). Reference: Tobias et al. (1991) Science 254, 1374-1377.

(無題) 削除/引用 No.2765-3 - 2014/01/25 (土) 09:42:58 - qq ＞pET系の発現ベクターをBL21に入れて、 タグは頭に付いているのか、それとも尻尾なのかで考え方もあろうかと思います。 pETのベクタ名くらいは、出しても良いのではないでしょうか？ ＞大腸菌内で、ある特別なタンパク質を積極的に分解するようなことが 特異的な分解系もあるでしょうが、タンパク合成不全の方を疑ってしまいます。 頭に疎水性の強いシグナル配列があったりすると、その前に大きめのタグを入れるとタンパク合成が増えそうに思いますけど、どうなんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2765-2 - 2014/01/25 (土) 09:41:43 - おお スタートコドンがうまく認識されてない可能性は?

大腸菌でのタンパク質発現系での発現量の違い 削除/引用 No.2765-1 - 2014/01/25 (土) 09:05:18 - May 最近、あるタンパク質を大腸菌で発現させたのですが、発現量があまりにも低くて困っています。 pET系の発現ベクターをBL21に入れて、目的タンパク質を発現させようとしたのですが、明らかに発現量が少ないです。 このタンパク質がタグつきで発現させたものも同時に行って、CBBとWesternをしましたが、このタグつきタンパク質は大変よく発現しましたが、タグなしはWesternでかろうじて見えるほどです。 その差は100〜1000倍以上かと思います。 Sequenceはして、問題ないことは確認していますし、Westernでは薄いながらも、目的のサイズに検出されています。 可溶性の問題かと思い、破砕液をボイルして、全量をCBBおよびドットブロットでタンパク質を検出しましたが、やはり発現が弱いです。 今までコロニーの違いをあまり気にかけていませんでしたが、もしかしてと思い、別のコロニーを拾って、同様にタンパク質を発現させましたが、すべてのコロニーで均一に発現が低かったです。 発現させたタンパク質が大腸菌の生育に問題があるわけではなく、コロニーサイズも、生育もまったく問題なかったです（タグ付タンパク質とまったく同じ生育）。 このコンストラクションはタグ付とまったく同時に行い、同じく生育させ、タンパク質を発現させていますので、ベクターの変異とかの問題も考えにくいです。 大腸菌内で、ある特別なタンパク質を積極的に分解するようなことがあるのでしょうか？ 今までの経験上、発現させたタンパク質が不溶性になることはよくありましたが、このように発現自体が低いことはなかったので、どなたかご存知でしたらぜひ教えてください。 よろしくおねがいします。

全19件 ( 1 〜 19 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---