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(無題) 削除/引用 No.2767-8 - 2014/01/28 (火) 03:30:06 - おお なんでgene specific primerを共通にする必要があるのかもよくわかりませんけど。 もしそういう方針なら複数のgene specific primerを使う手はあると思いますけど、どうしてでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2767-7 - 2014/01/27 (月) 04:40:07 - おお いずれにせよそれぞれの対象がその方法で検出可能なのかポジｺﾝ欲しいところです。1000bぐらいを増幅しているならもっと短い方が検出には有利かもしれません。 6merとか10merでも逆転写は可能とはいえ、スペシフィックな20mer以上のプライまーをつかってもうまくいかないケースもあるわけで、逆転写できていると過信するのはすこし危険です。 ですでに検出できないという結果を得られているようですが、ならば発現していないという結論も出せるわけで、まずは評価基準などよく考慮してみる必要はあるかもしれません。 個人的にはoligodTで逆転写して、同じ転写産物から増幅されるであろう数カ所をプライまーで設定して、どれも増幅されないなら発現している可能性は極めて低いというような話がわかりやすいと思います。 PCRはなにかと見えない部分がありますので、ノーザンなどもやってみる価値があるんではないかと。poly Aを濃縮するとまあそれでかからなかったらないなぁという感覚だとおもいます。 total RNAでRNA protection assayをすると同じプローブで複数のあいそフォームが設計によってはみれますし、感度、定量性は非常に優れています。

(無題) 削除/引用 No.2767-6 - 2014/01/27 (月) 03:24:24 - TK-1 > ある、発現量が少ないらしい、遺伝子ファミリーのmRNAをRT-PCRで増幅しようとしています。 > （発現量が少ないらしい、というのは、他種哺乳動物での、遺伝子特異的プライマーによるcDNA合成とnested PCRを実施している報告からの推測です） この推測に根拠はあるんですか。 > これまでの実験では、オリゴdTとランダムヘキサマーでcDNA合成をしても、PCR（サイクル数は35回）をしても、アガロース泳動で確認できるような増幅産物は得られませんでした。 ポジコンは何ですか？そのプライマーはちゃんと使えるプライマーなんですよね。そうでなければ、どんな方法でcDNAを作ろうとあまり変わらない気がしますがいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2767-5 - 2014/01/26 (日) 21:14:26 - AA nested PCRしてみるのはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.2767-4 - 2014/01/26 (日) 19:25:21 - はな 独り言様 御助言をありがとうございます。ひとつだけのヘキサマー(や10mer）を用いて、遺伝子ファミリー全てのためのRT-PCRを実施してみます。 なお目的は、Predictとして登録されているファミリーのうち、どれが発現しているかを明らかにすることです。 またマイナーな動物種を扱っていまして、購入できるようなcDNAは無いです。

(無題) 削除/引用 No.2767-3 - 2014/01/26 (日) 09:22:10 - 独り言 やったことないけど、できるはずですよ。 でも何が目的なんですか？単に発現ベクター用のクローニングとかであれば、いろいろプライマー買ったり逆転写酵素を使いまくったり人件費かけたり検討するよりも、ESTクローンとか１万円で買った方が、確実に楽にクローニングできますよ。

(無題) 削除/引用 No.2767-2 - 2014/01/25 (土) 22:36:58 - はな 補足です。この遺伝子ファミリーは、それぞれが約1000bpです。

発現量の少ないmRNAのRT-PCR増幅 削除/引用 No.2767-1 - 2014/01/25 (土) 22:35:57 - はな いつも勉強させていただいております。どうぞよろしくお願いします。 ある、発現量が少ないらしい、遺伝子ファミリーのmRNAをRT-PCRで増幅しようとしています。 （発現量が少ないらしい、というのは、他種哺乳動物での、遺伝子特異的プライマーによるcDNA合成とnested PCRを実施している報告からの推測です） これまでの実験では、オリゴdTとランダムヘキサマーでcDNA合成をしても、PCR（サイクル数は35回）をしても、アガロース泳動で確認できるような増幅産物は得られませんでした。 そこで、3'末よりも少し上流の遺伝子特異的プライマーを合成して、増幅基のcDNAを少しでも多く合成したいと考えました。しかし、当方が扱う哺乳動物種では、遺伝子特異的プライマーを設計しようとしても、遺伝子ファミリー全てをカバーできるような、20mer程度のプライマーの設計は無理であることが判りました。 しかし、遺伝子ファミリー全ての3'末をよく検討すると、共通したヘキサマー程度(6merから10mer)であれば設計できることを見いだしました。そこで、質問です。 通常は、ランダムヘキサマー（かオリゴdTかGene Specific Primer) を用いるcDNA合成ですが、ひとつだけのヘキサマー(や10mer）を用いて、遺伝子ファミリー全てのためのRT-PCRを実施して、増幅産物を得ることに成功することは可能でしょうか？ もし可能なら、このような試みを記載した論文の御紹介もしていただけるとありがたいです。

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