プルダウンはすぐれた方法だけど、受容体って細胞膜あるものが多いので膜何回貫通とかいうのとかだと取り出すともしかして反応液中で不溶化しやすいんじゃねかもとかおもた。でいま、暇だったので下のような実験ちょっと考えてみた。（注：細胞内の受容体とかならば、すこし話は変わるから。）でもあくまで素人考えなので、もっといいアイデアがあればそっちに従った方がいい。
１)受容体持ってそうな培養細胞準備
、２)ペプチドおよびコントロール用のスクランブルペプチドをビオチン標識、３)それらを培地へポイ（当然だがペプチドとコントロール用のスクランブル配列のペプチドはそれぞれ別々のdishへポイする）、４)数時間インキュベート（37C or ４Cー受容体ごとインタナリゼーションしてそうなら４Cで長めがいいかも、その場合、HEPESbuffer系ならCO2インキュベタ内でなくてもpH変化避けられる））,５)培地除去し洗う、そのあと培地の代わりにPBSいれる。
６)膜非透過性架橋剤（下記12のとことの兼ね合いでこの場合、還元で結合が切れないタイプを選ぶ）をdishへポイ＆インキュベート（５〜６のこの辺は試薬の説明書とか見て）、７)PBS除去＆細胞洗い、８)界面活性剤入りライシスバッハーで細胞溶かす（受容体ーペプチド可溶化で来てるかどうかはチェックしたほうがいいかも。あと細胞総抽出液じゃなくて、あらかじめ膜画分を分離してそれを溶かしてもいいていうかそのほうがコンタミの蛋白質のバックグラウンド下がるので都合がいい）９)アビジン（ソフトリリースとかいう結合が弱いやつがいいかも、アビジン―ビオチンの結合力はハンパないから）ビーズとミクス＆インキュベート、10 )適当に洗う、11) SDS buffer中で加熱して溶出（この辺も説明書見て）、で電気泳動＆ウェスタン両方やる。でアビジンーHRPで検出、12) ペプチドとインキュベートした方でのみ見えるバンドがあれば受容体ーペプチド複合体がゲト出来てる可能性大。（ビオチン化って翻訳後修飾もあるし、カルボキシラーゼとかもビオチン持ってるしとかで細胞内にはビオチン化蛋白質ってわりとあるから、それらもアビジンと強く反応することがある。だから、コントロールでもバンドが複数見えるかもしれない。なんでペプチド側とコントロール側比べて前者にだけあるようなやつを選ぶ。）13) 電気泳動ゲルの対応する部分のバンドを切り出す（蛋白質量少なくてバンド見えなくてもとりあえず当該位置切り出す）14) LC-MS/MS解析する。15) 候補蛋白質同定、16)一応、他の方法でも検証 17) 終了
あとリガンドブロッティングとかで探すのも（もし使えそうなら非常に簡単なので）いいかもしれない。受容体―リガンドの探索には昔、しばしば使われてたって学生の時、先生が言ってた。 |
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