BioTechnicalフォーラム [臓器間のタンパク発現量比較]

臓器間のタンパク発現量比較

No.2831-TOPIC - 2014/02/17 (月) 13:51:25 - チャンプラス

いつも参考にさせて頂いております。
WBで臓器間のタンパク発現量を比較する際に用いる内在性コントロールについて質問させて下さい。

臓器特異的に発現していると思われるタンパク質の機能解析を大学院での研究テーマにしています。そのタンパク質はBioGPSというサイトで臓器特異的な発現プロファイルを示しており、実際マウスの各臓器から抽出したRNA(cDNA)を用いたRT-PCRでも同様の結果(内在性コントロールにはtaqmanの18sを使用)でした。市販の抗体がなく、抗体作製もなかなかうまくいかなかったため、mRNAの情報のみでもしょうがないと思っていたのですが、予期せずWBで標的タンパク質を良好にdetectできる抗体が作製できたので、タンパク質レベルでも臓器特異性を証明しようと試みました。しかし、各臓器から抽出したタンパク質を、タンパク量を(数字上)完全に揃えた上でWBしてみましたが、いくつか試した内在性コントロール(β-Actin、GAPDH、HSP90)のバンドが何れもバラバラでした。

標的タンパク質のバンドは臓器特異的に検出できているので、泳動したタンパク量が同じであることを示すことができれば、論文のfigureとして使用したいと考えております。

WBで臓器間のタンパク発現量を比較する際に用いる内在性コントロールについてか、同じタンパク量をapplyしたことを示す方法について知恵を貸して頂けますと幸いです。よろしくお願いします。
　

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No.2831-4 - 2014/02/17 (月) 20:40:42 - 名無し

組織違えば、そりゃ、actinも、GAPDHもhsp９０も（その他の多くの蛋白質も含めて、
細胞内での相対的存在量は組織間で違うのは当然なので、同一蛋白質量でアプライすればそういう結果になるのはむしろ自然な姿と思う。
他の人も言ってるように、ウェスタンの検出が済んだ後に、メンブレンを蛋白質染色してレーン全体をスキャン、定量してその値で補正すればいいとおもう、ていうかいつもそうしてる。ポンソーもいいけど感度的にあれなのが難点で、普段はCBBで染めてる。具体的な方法（って言ってもごく単純な操作だけど）はネットで検索すれば結構出てくるよ。

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No.2831-3 - 2014/02/17 (月) 15:54:09 - TS

おおさんと同様の意見ですが、メンブレンがあるならPonceauSで染めて（ブロッキング後だと少し質が落ちるかもですが）それで補正してはどうでしょう。

私は最近はもっぱらPonceaSで染めたメンブレンのシグナルを使って、標的タンパク質の発現量を補正しています。
以下の論文でも、リファレンスタンパク質で補正することと、PonceauSで補正することは同等だと言っています。
（わたしの感覚ではPonceauSのほうがダイナミックレンジが広いような）
Anal Biochem. 2010 Jun 15;401(2):318-20.

Bio-radも、それもありっていうスタンスで製品を売り出しています（これは他の染色法ですが）。
http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6349.pdf

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No.2831-2 - 2014/02/17 (月) 13:57:57 - おお

わたしはブロットしたあとポンゾーsでmembraneをそめています。もし手元にすでにアプライしたサンプルのleft overがあるなら、それを流してゲルをCBBなどで染色してもいいかとおもいます。

臓器間のタンパク発現量比較

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No.2831-1 - 2014/02/17 (月) 13:51:25 - チャンプラス

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