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お返事遅くなってすいません。 削除/引用 No.2885-20 - 2014/03/22 (土) 01:43:32 - 月詠 1レーンあたりにアプライするタンパク量を見積もってみてください。 たとえば、タンパクAを、5 μg/mLの濃度で、500 μL用いたとすると、試験管中のタンパクA当量は2.5 μgです。 菌体に約1〜10%結合した場合、遠心で（菌体と共に）試験管底に回収できるタンパクA量は、0.025〜0.25 μgです。 それを、50 μLのサンプルバッファーに溶解して、そのうち10 μLをゲルにアプライすると、1レーンあたりのタンパクA量は、約0.005〜0.05 μg/laneになります。 その量を十分検出できる抗体であるにも関わらず検出できないとしたら、（少なくともこの試験管内の条件では）タンパクAは菌体にほとんど結合していないという結論になると思います。 逆にそこまで検出感度がよくない場合は、最初の試験管内のタンパクA量および菌体量を増やさないといけないでしょう。 抗体のおおよその検出感度は、タンパクAのみを、0.1、1、10、100 ng/laneぐらいの範囲で濃度をふってブロットすれば判断できると思います。 ただ、タンパクA濃度を濃くしないと菌体との結合が観察できないとすれば、タンパクAと菌体（表面のタンパクB）との親和性はそれほど高くないということになるでしょう。 タンパク等のビオチン標識あるいは蛍光標識については、複数のメーカーからラべリングキットが市販されていますので探してみてください。

(無題) 削除/引用 No.2885-19 - 2014/03/19 (水) 12:45:29 - 細菌 月詠様 考えたのですが、5マイクログラムのタンパクAの濃度では、細菌と反応させて回収（結合）するタンパク濃度は、多くても5マイクログラム未満になります。 そのため、WBでも検出しにくくなるのかと思いました（WBの検出限界はpgのことを考えると、検出できるとは思うのですが）。 通常は、もっと高濃度のタンパク濃度で反応させるものでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2885-18 - 2014/03/19 (水) 10:33:55 - 細菌 月詠様 大変わかりやすい御指導を御親切にありがとうございます。 以下、長文になりますが、ご指導いただけたら幸いです。 ＞「目的タンパクAと細菌の受容体タンパクBの結合は、確認できる」という結論に至れるのでしょうか？　（菌体の代わりに）単離･精製したタンパクBを用いた実験結果があるのでしょうか。 ｢目的タンパクAと細菌の受容体タンパクBの結合は、確認できる」を証明するために、タンパクBを単離･精製しております。単離･精製したタンパクBを用いた実験（ELISA）も立ち上げて、検証しようとしております。 ＞「野生株菌体はタンパクBを発現している、変異株は発現していない」ということが結果を考察する上での前提条件なわけですから、その前提条件に間違いがないか裏をとっておいた方がよいと思います。 御指摘通り、洗浄等でタンパクBが脱離する可能性もあることから、タンパクBの発現を確認致します。 ＞月詠様の御指摘通り、WBを使って、「目的タンパクAと細菌の受容体タンパクBの結合は、確認できる」を証明しようと思っております。 細菌はCFUで菌種間の菌数をそろえ、念のため、CFUをそろえた菌液のタンパク濃度ををA280で測定したところ、決めた量の菌液をマイクロチューブに用意した場合、菌液のタンパク濃度はおよそ５マイクログラムであることを確認しました。 そのため、混和する目的タンパクAのタンパク濃度も、およそ５マイクログラムとし、両者を反応させました。 決めた条件（環境・時間）で混和した後、遠心機でプルダウンしたところ、タンパク濃度が５マイクログラムのせいか菌のペレットが見られませんでした（予測はしておりました）。上清を少し残し、PBS-Tで３回洗浄致しました。 その後、目的タンパクAを検出する抗体を用いてWBで目的タンパクAの検出を試みたのですが、検出できませんでした。 使用した抗体は、目的タンパクAをWBで検出できる抗体なのですが、データシートにはWBでタンパクAを検出した画像はありません、、、また今までWBでは使用したことがない抗体のことから、WBではあまり機能しない抗体かもしれません。。。 今回の検証では、目的タンパクAが必ず検出されるサンプル（ポジティブコントロール）を置かなかったため、置いて再度抗体の善し悪しから検証する必要があると思っております。 一方で、 ＞検出用の抗体が手元にない場合は、タンパクAを蛍光やビオチン等でラベルして検出することもできます。 とのことなのですが、タンパクAのみを蛍光でラベルしてから、細菌と混和し、タンパクAを励起して検出する方法について、もしよろしければ、ご指導いただけたら幸いです。 なにとぞ、宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2885-17 - 2014/03/14 (金) 19:34:18 - 月詠 実験結果の解釈ですけど、「野生株と変異株間にはっきりとした差異はいまいち見えません」ということは、受容体タンパクBを欠損しているはずの変異株菌体も野生株と同じくらいタンパクAに（タンパクB非依存的に）結合しているということですよね。 だとすれば、「菌体表面にタンパクBがあってもなくても、菌体はタンパクAに結合している」ということになりますから、「タンパクAは菌体に結合するが、（野生株菌体上の）タンパクBに特異的に結合しているわけではない」という結論になりませんか？ 本実験の場合、野生株と変異株の間に明確な差が（再現性をもって）検出されて初めて、「タンパクAの菌体への結合は、タンパクB依存的である」という結論が導かれ、その上で「タンパクAがタンパクBを受容体として結合している」という機序の可能性を示唆することができるはずですけど、両株間に明確な差異が検出されていないのに、どうして「目的タンパクAと細菌の受容体タンパクBの結合は、確認できる」という結論に至れるのでしょうか？　（菌体の代わりに）単離･精製したタンパクBを用いた実験結果があるのでしょうか。 変異株と野生株で差異がない、あるいは実験結果が安定せず再現性がないのは、現在の培養方法（菌体調整法）では「野生株菌体表面上のタンパクBの発現が不安定」だからかもしれません。 変異株は遺伝的にタンパクBを欠損していますから、どのような培養条件でもタンパクBを発現することはありませんけど、野生株の方は、遺伝子は正常でも恒常的にタンパクBを発現させていないかもしれませんよね。同じように培養しているつもりでも毎回発現量に差があるのかもしれません。あるいは鞭毛タンパクのように、菌体調整時の洗浄次第で菌体から脱離したりしなかったりということがあるかもしれません。 いずれにしてもこの実験系では、「野生株菌体はタンパクBを発現している、変異株は発現していない」ということが結果を考察する上での前提条件なわけですから、その前提条件に間違いがないか裏をとっておいた方がよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2885-16 - 2014/03/14 (金) 19:28:22 - 月詠 ご参考になれば幸いです。 （１）試験管内での反応はマイクロチューブ内でよいのか？ 反応は、一般的には、マイクロチューブで大丈夫です。 ただし、タンパクAが管壁に吸着しやすくロスが多いのであれば試験管の素材は検討しなければいけません。 吸着反応時の検討課題は、試験管内の条件をどれだけ生理的条件に近づけれるかだと思います。 どういうコンテクストの中で、タンパクAとタンパクBの特異的結合を論じようとなさっているのかは存じませんが、たとえば、胃内でピロリ菌に作用する抗菌ペプチドであれば、たとえ（試験管内の）中性pH条件で菌体に結合したとしても、本当に生理的条件（胃内の酸性pH条件下）で意味のある実験結果なのかまでは判断できませんよね。 あるいは、中性pHのリン酸バッファー内では不活性型で結合しなくても、酸性pH条件下であれば活性型に変化して結合するペプチドだったら、中性pH条件だけで実験してしまうと重要な知見を見逃してしまうことになってしまいます。 ELISAのような抗原抗体反応であれば、そこまで反応条件を気にしなくてもいいわけですけど、リガンドと受容体の結合ですから反応条件は慎重に検討された方がよいと思います。 （２）遠心機でプルダウンする目的は？ 菌体とタンパクＡを混合して反応させた後、菌体に結合したタンパクAと結合しなかったタンパクAを分離しなければなりません。 そのために遠心分離により菌体（＋タンパクA)を沈殿にして、（菌体に結合せず）上清中に残留したタンパクAを除去します。 数回、菌体を洗浄（洗浄用バッファーに再懸濁して遠心分離）すれば、非特異的結合を減らすことができるかもしれません。 （３）洗浄バッファーはPBSTでよいのか？ 担体となる粒子が細菌細胞ですので、PBS(-)に加えるtween80の濃度は検討の必要があるかもしれません。 溶菌してしまったり、受容体タンパクBが野生株菌体の表面から脱離するような濃度でなければ問題ないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2885-15 - 2014/03/14 (金) 08:40:40 - 細菌 月詠様 　御指導誠にありがとうございます。 　 　私が考えている実験目的ならびに期待している結果は、月詠さまのおっしゃる通りであります。 　月詠さまの実験系に共感致しました。 （１）〜（３）のステップを行う上で、詳細な方法を調べたいと思います。 ・試験管内での反応はマイクロチューブ内でよいのか？ ・遠心機でプルダウンする目的は？結合をより強固にするためか。 ・洗浄バッファーはPBSTでよい　のか？ 　現在行っているELISAでは、目的タンパクAと細菌の受容体タンパクBの結合は、確認できるのですが、野生株と変異株間にはっきりとした差異はいまいち見えません。見える時もあるのですが。。（今回使用している変異株は、野生株のタンパクBを欠失させたものです。） 　 タンパク同士の結合に、菌体を使うのは難しいのかなとも感じております。 月詠さまの実験系でどのくらい解決するかわかりませんが、行ってみたいと思います。 　御指導誠にありがとうございます。

御相談の趣旨からは外れているのですけど、、、 削除/引用 No.2885-14 - 2014/03/13 (木) 20:35:20 - 月詠 要するに本実験の目的は、「当該タンパク分子（仮にタンパクAとしておきます）が、細菌表面のなんらかの受容体タンパク（タンパクB）に特異的に結合するか否かを検証する」ということですよね。 「変異株ではその受容体に相当するタンパクBが細菌表面に発現していないため、タンパクAは野生株とは結合するが、変異株とは結合しない」という結果を期待されているのですよね。 （全体的な研究計画が判然としないので確定的なことはいえませんが）わたしだったら、吸着系と検出系を逆にして実験系をプラニングします。 つまり、「タンパクAをコーティングしておいて、ウェル内に残存（結合）した菌量（タンパクB）を定量比較する」のではなくて、「担体粒子＋抗体」でプルダウンする免疫沈降法の原理を援用して、 （１）細菌菌体とタンパクAを（試験管内で）混合して、菌体に吸着させる （２）菌体（＋タンパクA)を遠心機でプルダウンして、結合していないタンパクAを洗浄除去後、サンプルバッファーで溶菌 （３）菌体に結合していたタンパクAをウエスタンブロット法等で半定量的に検出 「タンパクAは、野生株菌体には結合するが、変異株菌体には結合しない」という仮説が真であれば、「タンパクAは、野生株でプルダウンした場合は検出され、変異株でプルダウンした場合には検出されない」という結果が(理論上）得られるはずです。 検出用の抗体が手元にない場合は、タンパクAを蛍光やビオチン等でラベルして検出することもできます。 もちろん、菌体への非特異的吸着によって、変異株にも吸着する可能性はありますが、それは相談者様の実験系でも同様ですから、いずれにしても、菌体への非特異的結合を否定するための対照群は、考慮しないといけないです。 野生株と変異株で菌体のサイズやクラスター化に差がないのであれば、吸着に用いる菌体量は、濁度あるいは乾燥重量等で合わせておけば十分かと思います（対数増殖期に回収してCFUで合わせるのが最良ではありますが）。 また、野生株と変異株の間で受容体タンパクBの表面発現に明らかな差異が確認できているのであれば、終夜培養でも（死菌体が多少含まれていたとしても）、最終的な結論にはさほど影響を与えないでしょう。 逆に培養条件次第で受容体タンパクBの発現量がおおきく変動するのであれば、まずは培養のステップから実験条件を厳密にコントロールしていく必要があります。たとえば、現在の培養条件では、実は野生株でもタンパクBの発現が抑制されているとすると、タンパクBを欠損している変異株と菌体表面は変わらないわけですから、野生株と変異株の間でタンパクAの結合量に差はないという結果になってしまい誤った結論を導くことになりかねませんから。 それから、粒子状の細菌を懸濁した液に含まれる総タンパク濃度を280 nmの吸光度で定量しても、原理的に考えて信頼に足るデータになるとは到底思えません。

(無題) 削除/引用 No.2885-13 - 2014/03/13 (木) 09:48:36 - ~ 希釈してODをいいところに持っていって測定しても、 同じ菌種でODとCFUが比例しないことはあります。 死菌が多いのか、生菌あたりのODが変わるのかはちゃんと調べていませんが。 1ウェルあたりの（生）菌数をコントロールするためには菌数測定が必要であり、 →OD　　　　:菌数と相関があることを予備試験で確認する 　　　　　　（細胞の状態により相関がない可能性がある） →タンパク質：同上 →RNA　　　 ：同上 →DNA ：基本的には相関しているので検討は最小限で済むが、 　　　 RNAと分けるか、RNAこみで相関を確認する →CFU　　　 ：（生）菌数の値そのものだが、測定結果が出るまでに時間がかかる 等の測定項目について、必要な予備検討を行う必要があるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2885-12 - 2014/03/13 (木) 09:17:05 - 細菌 ああ様 ＞同じ菌株由来なので，濁度でよいかと思います。 料菌株ともに濁度が0.5位の対数増殖期の細胞を用いるのがよいと思います。 御指摘ありがとうございます。 >OD600で合わせた菌液のタンパク濃度が異なるのが気になります。。。 ＞A280はタンパク質濃度を示していないと思います。 野生株と変異株を培養して回収するときの濁度は同じでしょうか。 濁度は同じくらいで、多少調整致します。 濁度を合わせた菌液のタンパク定量すると、値にばらつきがありました。

(無題) 削除/引用 No.2885-11 - 2014/03/13 (木) 09:10:37 - ああ >今回は菌種が異なるというか、野生株とある分子を欠失させた変異株を使用しています。 同じ菌株由来なので，濁度でよいかと思います。 料菌株ともに濁度が0.5位の対数増殖期の細胞を用いるのがよいと思います。 >OD600で合わせた菌液のタンパク濃度が異なるのが気になります。。。 A280はタンパク質濃度を示していないと思います。 野生株と変異株を培養して回収するときの濁度は同じでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2885-10 - 2014/03/12 (水) 22:03:50 - qw 280nmの吸光度からタンパク定量は、溶菌した抽出液でないと無理じゃないかなと、思います。菌と菌の間を通過する光は、培地というかPBSの吸収だけを見ているに等しいわけで、普通の280nmのタンパクの吸収を見ていることにはなりそうに思えません。 例えば、miniprepのようにSDSとNaOHで溶菌し、中和しないで遠心上清を得て、260nmと280nmの吸光度から、DNA+RNAなりタンパクなりを推定するのが現実的かなと、思います。 qqは他の方が使っているようなので、隣に移ります。

(無題) 削除/引用 No.2885-8 - 2014/03/12 (水) 17:49:49 - mon 大腸菌で、OD600と（生）菌数が比例するのは、（たしか）0.1〜0.6くらいですからご注意を。 0.6を超えると、希釈して測定しないとぶれますよ。

(無題) 削除/引用 No.2885-7 - 2014/03/12 (水) 16:21:35 - ~ >OD600で合わせた菌液のタンパク濃度が異なるのが気になります。。。 ODとタンパク質量が比例するという仮定について、どのくらいの基礎データを取っているのでしょうか？ 野生株、変異株それぞれの中では、実験ごとのODあたりのタンパク質量がそろっているのでしょうか？ そうでなければODあたりのタンパク質濃度が一定という前提が成り立ちませんし、 揃っていたとしても変異によって増殖曲線が変わることはありますよね。 >一晩培養した菌 一晩経ってもまだlog phaseを維持できているのですか？ それともstationary phaseやdeath phaseに入っているのですか？ Log phaseだからといってタンパク質量が不変ではないかもしれませんが、 どの位実験系をコントロールされているのでしょうか？ http://mic.sgmjournals.org/content/53/2/237.full.pdf

(無題) 削除/引用 No.2885-6 - 2014/03/12 (水) 15:45:00 - 細菌 ああ様 ＞菌をどのように処理してからウェルに入れているのでしょうか？ 菌丸ごとのように読めますが、それであっているのでしょうか。 一晩培養した菌を遠心してできたペレットをPBSで懸濁させたものを使用してます。そのため、菌丸ごとを使用しています。 ＞比較したいのは、複数の菌種(溶菌していないインタクトなもの)についての、それぞれある分子に結合する菌数でいいのでしょうか？ その通りです。 今回は菌種が異なるというか、野生株とある分子を欠失させた変異株を使用しています。 OD600で合わせた菌液のタンパク濃度が異なるのが気になります。。。

(無題) 削除/引用 No.2885-5 - 2014/03/12 (水) 13:31:18 - ~ それと、ELISAの検出系は菌種が異なることをカバーできるものでしょうか？ 測定結果がある分子に結合した菌数そのものではなく、菌の種類によってバイアスがかかる場合、 それを踏まえた評価が必要になるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2885-4 - 2014/03/12 (水) 13:26:14 - ~ 菌をどのように処理してからウェルに入れているのでしょうか？ 菌丸ごとのように読めますが、それであっているのでしょうか。 そうであれば、比較したいのは、 複数の菌種(溶菌していないインタクトなもの)についての、それぞれある分子に結合する菌数 でいいのでしょうか？ そうだとすると菌種が違う場合、 ODと生細胞数や、タンパク質量と生細胞数の関係は、必ずしも同じになりませんよね。 ODで揃えた場合のタンパク質量が異なることは何ら不思議ではないでしょう。 また、単純にCFUを揃えることだけを考えてしまうと、 死菌の影響を見落とすことになってしまいます。 調べたいのは菌表面の分子とある分子の結合でしょうから、死菌も同じ反応をしてしまうでしょう。 それらを踏まえると、死菌数が少ないことが期待できるような培養を行い、 ある程度濃度を振ってウェルにアプライし、同時に同じ希釈率でのCFUを測定し、 CFUとELISAの結果を比較するのがいいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2885-3 - 2014/03/12 (水) 12:58:49 - 細菌 ああ様 御指摘ありがとうございます。 OD600 nmで調節したにも関わらず、なぜ、タンパク濃度に差が生じるのが気になっています。 タンパクアッセイなので、余計に気になっています。。。 OD600 nmでの値はあくまで濁度であること、また、ああ様のおっしゃったように、280 nmでは正確に測定できないかもしれないことから、BCA assayなどを利用して、タンパク濃度を測定するとよいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2885-2 - 2014/03/12 (水) 12:41:55 - ああ 280 nmに吸収を示す物質はタンパク質以外にもあるので正確でないような気がしますが。280 nmで合わせることはよくあることなのでしょうか。あまり聞いたことがないです。 あと，濁度とCFUは異なります。菌数を合わせたいならCFUで，おおざっぱでもよいなら濁度がよいかと思います。

細菌の取扱い、細菌を使用したELISAについて 削除/引用 No.2885-1 - 2014/03/12 (水) 12:26:52 - 細菌 お世話になっております。 以下、長文になりますが、ご指導頂けましたら幸いです。 数種の細菌を細胞等に作用させる場合、600 nmもしくは660 nmにおける濁度を約1.0に調整した（CFUを調整した）菌液を作用させる方法が、行われているかと思います。 一方で、280 nmにおける吸光度でタンパク濃度を測定し、調整した菌液を作用させる方法も行われているかと思います。 現在、細菌とある分子との結合を調べるため、ELISAを行っています。 方法としては、ある分子を決まったタンパク濃度（今回の実験では、5 microg/well）をコートし、ブロッキングを行った後、細菌を作用させるという方法です。 細菌を作用させる際、数種の菌種間で600 nmで約1.0に調整した（CFUを調整した）菌液を作用させるべきか、280 nmで調整したタンパク濃度（今回の実験では、5 microg/well）を作用させるかを迷っています。 と言いますのも、600 nmで約1.0に調整した菌液を280 nmの吸光度で測定すると数値（タンパク濃度）に多少の違いが生じてしまいます。 タンパク同士の関係を調べるELISAですので、タンパク濃度で調整した菌液を使用する方がいいかとも思っておりますが、なぜ差が生じるのか、また600 nmの濁度で調整した（CFUを調整した）菌液を使用すべきか、280 nmで調整したタンパク濃度を使用すべきか、どちらがいいのでしょうか。 ご指導頂けましたら幸いです。

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