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(無題) 削除/引用 No.2903-11 - 2014/03/21 (金) 20:35:39 - ぺーぺー >[Re:10] AAさんは書きました : > ossi さん 情報有り難うございました、教えていただいた抗体はClontechのCat. No.632475ですよね。説明書*1によると、免疫しているのはDsRedそのものではなく、Reef Coral Fluorescence Protein(RCFP)に属するZsYellowであり、DsRedのderivativeではないようです。よく知りませんが、総称としての赤色蛍光タンパク質には複数の由来があるけれども、何れにしてもRCFPファミリー？に属するものが多いのであんまり問題にならないのかもしれません。 > 自分で書いていて思ったのですが、 > 例えばGFP抗体にはYFPにもCFPにも反応する抗体がありますが、 > そういった抗体はDsredには交差するものなんでしょうか？ これはRFPという言葉のもたらす語弊だと思うのですが、元々の意味としてGFPというのはオワンクラゲがもつ遺伝子の名前です。緑色系の蛍光タンパク質の総称ではありません。現実的にはEGFPやらも含むと思いますが、とにかくオワンクラゲの遺伝子に関連した表現です。そして、YFPやCFPというのはGFPだかEGFPだかの1アミノ酸変異でつくられたGFP派生物です。したがって、ほとんど抗原性を維持しているのです。 私はRFPというのが特定の蛍光タンパク質の事を言っているのか、総称なのか、はたまた関連性のあるものなかのを良く知らなかったので混乱していたのです。教えていただいた情報から、RFPが互いに関連した遺伝したとみなしていいのだというのは理解出来ました。 *1 http://www.clontech.com/JP/Products/Fluorescent_Proteins_and_Reporters/Fluorescent_Protein_Antibodies/ibcGetAttachment.jsp?cItemId=27625&fileId=6464539&sitex=10025:22372:US

(無題) 削除/引用 No.2903-10 - 2014/03/20 (木) 21:57:56 - AA ossi さん なるほど、GFP由来の赤色蛍光タンパクはほとんど出回っていないのですね。 クロンテック社に問い合わせた時に、 「AcGFP1とRCFPは構造が非常に似ているので免疫原性がある」 と説明されたので鵜呑みにしておりました。 全くお恥ずかしい限りです。訂正して頂いてありがとうございました。 自分で書いていて思ったのですが、 例えばGFP抗体にはYFPにもCFPにも反応する抗体がありますが、 そういった抗体はDsredには交差するものなんでしょうか？ そうであれば、tdTomatoレポーターマウスにもその抗体で使えそうな気もしますが。。。

(無題) 削除/引用 No.2903-9 - 2014/03/20 (木) 20:45:44 - ossi AAさん、 オワンクラゲのGFP(AvGFP)由来のRFPは出回っていないと思います。 色んな人がチャレンジして挫折して、結局サンゴ由来のものが見つかったのだと思います。 CFPやYFPなどはAvGFP由来のものが多いですよね。 一方でtdTomato、mCherryなどのRFPはDsRed由来の変異体(Shaner et al. 2004)なので、アミノ酸配列が非常に似ており、DsRedを抗原に作られたRFP抗体でも染色可能なのだと思います。 それでも、下記の例のように、ロットが変わると染まらなくなる場合もあるようですが… https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100004743

(無題) 削除/引用 No.2903-8 - 2014/03/20 (木) 16:56:11 - AA ぺーぺー　さん 確かに、オワンクラゲのGFP由来であるRFPと造礁サンゴ由来のDsredに対して 同じ抗体で良いのか、と言うのは私も疑問に思いました。 同じくRFP抗体を売っているクローンテック社によれば、これらのタンパクは 由来する生物は異なるものの高い相同性を持つため同じ抗体で反応する、 とのことでした。 実際、データシート上のWB像ではすべて反応しています。 ただ、個人的な経験ですが、MBLからサンプルでもらった抗体でtdTomatoのWBをしましたがうまく行きませんでした。 mRFPのコンストラクトを持っていなかったため、ポジコンをおいていなかったので なんとも言えない条件ではあるのですが、抗体としてイマイチな印象を持っています。 OK　さん 抗体はどちらもよく染まりますが、プロメガのものはモノクロなので ロット差がないぶん使いやすいかもしれません。 結局、二重染色する相方の宿主次第な気もしますが。。。。

(無題) 削除/引用 No.2903-7 - 2014/03/20 (木) 13:26:25 - OK AAさん いろいろと有用な情報をお教えいただきありがとうございます。 Tomatoの蛍光はそれほどまでに強く安定なのですね。 抗LacZ抗体での染色もうまくいくのであれば何かと便利ですので、お教えいただいた情報を元にトライしてみたいと思います。 重ねて質問で恐縮ですが、抗LacZ抗体は、PromegaのものとCappelのものとで、どちらかが感度がよいor使いやすいということはありますでしょうか？ mouseとrabbitの違いはあるようですが。。。

(無題) 削除/引用 No.2903-6 - 2014/03/19 (水) 21:07:50 - ぺーぺー 確かに免染でLacZが染まりにくいとは聞いたことがあるような……。 AAさん 横から質問失礼しますなのですが、抗RFP抗体って使ったこと無いのですがDsRed由来だったら何で反応するのでしょうか？エピトープ決定されていて、確認するのでしょうか？前から疑問に思っていたのです。

(無題) 削除/引用 No.2903-5 - 2014/03/19 (水) 17:18:52 - AA 抗LacZ抗体としては、Promegaのもの(Z3783)とcappelのもの(559761)を使っています。 これらにかぎらず色々な抗体が使われていると思いますが、 個人的な経験上、固定が弱いと染色性が悪い印象があります。 4%PFAでは一晩の後固定は必須です。 免染に関してはtdTomatoは自身の蛍光を見ていました。 CAGが付いているためかシグナル自体は非常に強く、 肉眼でも発現部位は赤く見えます。 4％PFAで固定し、薄切したサンプルを1年以上−30度で保存したものを 共焦点で見たことがありますが十分観察出来ましたので、それなりに持つのだと思います。 ちなみに、RFP抗体はMBLのものが比較的汎く使われているようです。

(無題) 削除/引用 No.2903-4 - 2014/03/19 (水) 16:01:23 - OK ぺーぺーさん　AAさん ありがとうございます。 抗LacZ抗体を用いた免疫染色も考えたのですが、現在持っているLacZマウスをいただいたラボの方が染色がうまくいかなかったとおっしゃっていたので、躊躇していました。 もしご存じなら、おすすめの抗LacZ抗体をお教えいただけますでしょうか？ また、AAさんのおっしゃる、 「tdTomato自体の蛍光が非常に強いため気になりませんが、 例えばクエン酸バッファー中での抗原賦活などすると蛍光は消失するので、 賦活化の必要な抗体との二重染色には苦労するかもしれません。」 ということについて、お伺いしたいのですが、 Tomatoマウスを用いてTomatoの発現を評価、もしくは二重染色をする場合には、抗Tomato抗体を用いて染色するのではなく、Tomato自身の発する蛍光を用いて直接評価するのが一般的ということでしょうか？ 抗Tomato抗体を用いるなら、抗原の不活化の過程でTomatoの蛍光が消失してもあまり問題ないのかと思ったので…。 またTomato自身の蛍光は、標本にした場合、どれぐらいの時間保持されるものなのでしょうか？ 非常に初歩的な質問かもしれませんが、宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2903-3 - 2014/03/19 (水) 15:07:19 - AA 個人的には同じROSA locusのROSA-LSL-tdTomatoマウスをおすすめします。 (ジャクソンで売っています。(B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)) ROSA遺伝子座にCAGプロモーターと一緒に入っているので、LacZよりも強く発現します。 同じCreマウスでもLacZで検出できないCre発現を検出できることもあります。(我ながら仕組みがわかりません。) CreERT2は組換効率が低いので感度の高い系統をおすすめします。 ただ、RFPはあまり良い抗体が無いようです。tdTomato自体の蛍光が非常に強いため気になりませんが、 例えばクエン酸バッファー中での抗原賦活などすると蛍光は消失するので、 賦活化の必要な抗体との二重染色には苦労するかもしれません。 ちなみに抗LacZ抗体にも良いものは多数存在しますし、それを用いたIHC/IFもよく行われています。

(無題) 削除/引用 No.2903-2 - 2014/03/19 (水) 12:11:00 - ぺーぺー 良く知りませんが、抗LacZ抗体くらい売っているんじゃないですか？

レポーターマウスについて 削除/引用 No.2903-1 - 2014/03/19 (水) 11:38:15 - OK いつも勉強させていただいております。 現在、とあるCreERマウスとRosa26-LacZマウスを用いてlineage tracingを計画しております。 LacZマウスは保有しているのですが、今後、免疫染色を用いて他のタンパクとの二重染色も必要になると考えており、LacZ以外のレポーターマウスも入手しておいた方がよいかと考えております。 具体的には、floxedSTOP-RFP、GFP、YFPマウスといった類になると思いますが、 免疫染色のしやすさや発現の強さ、入手の容易さ（出来れば国内で入手したいです）等から、何かお薦めのマウスがあればご教授いただけませんでしょうか。 また、このようなレポーターマウスを選定する際は、TgマウスではなくRosa等のknockinマウスを選ぶ方が一般的でしょうか？ ご教授のほど、よろしくお願いいたします。

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