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みなさん、助言していただき、ありがとうございます。 削除/引用 No.2915-14 - 2014/04/02 (水) 20:36:04 - mine いろいろ、検討した結果、ゲノム編集を行うことにしました。 CRISPR/Cas9を用いたいと考えています。 みなさん、貴重なご意見をたくさんいただき、ありがとうございました！！ ぺーぺーさん ご紹介していただいた本を購入させていただき、ただいま勉強中です。以前TALENの作製法の論文を読んだときに、複雑だと感じたのですが、ポイントも図も非常に分かりやすいです。 asanさん Addgeneのも候補に挙げつつ、具体的にどうしていくかを、同じラボのひとと話し合っています。 おおさん CRISPRを動かすにも少し時間がかかりそうなのと、２種の細胞を同時に行なうのも難しそうなので、片方の種について、タンデムを行なうことにしました。

(無題) 削除/引用 No.2915-13 - 2014/04/02 (水) 02:44:53 - おお shRNAで半分とかいくらか効果が見られていて、それでは十分でないならタンデムにつないだ発現用プラスみどというてはあるようです。

(無題) 削除/引用 No.2915-12 - 2014/04/02 (水) 02:42:31 - おお transientでいまいちのようなので(もちろんその時の効率にもよりますが)シングルクローンの安定発現株でどこまで望みがあるかなぁというのが私の個人的な感想ですが、、、

(無題) 削除/引用 No.2915-11 - 2014/03/28 (金) 13:02:16 - asan 　ゲノム編集に関しては、詳しくは色々考える必要はあるにせよ単純化していうと今から(少なくとも培養細胞で）始めるならtalenのメリットはあまりないでしょう。というわけでcrispr/casです。 　最近色々なメーカーがなんかカスタムでやってますが、Addgeneでコンストラクトを入手して自分でやっても全く難しくないですし、私のラボではとくに問題なく培養細胞ではワークしてますよ。ちなみにリポフェクションやエレポを使うならnucleaseは一過的にしか発現しないのでゲノムへのランダムインテグレーションしたクローンとかあえて取らなければ発現は残らないですよ。 色々考える点はあるにせよ、場合によっては落ちないノックダウンをあれこれ頑張るよりも設計も簡単という印象ですけどね。

(無題) 削除/引用 No.2915-10 - 2014/03/28 (金) 07:36:56 - ぺーぺー 私も買おうかな？と悩んでいるのですが（同じ職場の人は居ないので宣伝じゃないです！）、下にリンクを貼った書籍は最近出版されていて、かつ英書を含めて見ても大分安いように見えます。指導者に相談して買ってもらうのも一つの考えかと思います。 多分、切った貼ったの作業が圧倒的に簡便なので、今後はCRISPR/Cas9が普及するのではないかというもっぱらの話です。 個人的には培養細胞の場合には特殊なnucleaseが発現し続けるのは非常に気色悪いです。トラフェクは考える必要があるんじゃないでしょうか。 https://www.yodosha.co.jp/jikkenigaku/book/9784758101905/

またまたありがとうございます！ 削除/引用 No.2915-9 - 2014/03/27 (木) 12:09:56 - mine 少しずつ方向性が見えてきました。 ありがとうございます。 モモさん いただいたアドバイスから、イヌの細胞はシングル化できるので、昨日さっそくポリクローンをモノクローン化する準備をしました。 コロニーが得られるのを楽しみに待っているところです。 （現在得ているポリクローン中にかろうじて強くノックダウンされている領域が一部得られました！） ウイルスを使用した系を用いるかゲノム編集を行うか、現在考えているところです。 asanさん shRNAはsiRNAと同様にはなかなかいかないのですね。 勉強になりました。 確かに実際にshRNA安定株をいくつか作製してみて、siRNAで効果のある順でshRNA安定株が得られるわけではないことも感じました。 タンデムにつなぐことはすぐ行うことも可能なので、やってみたいと思います。 最大６個なのですね。 ウイルスの系に関しては、所属ラボに設備がないので、隣のラボでキャビネットを借りることが可能であることをお願いしました。 しかし、ゲノム編集のほうがいっそ手っ取り早いのではないかとも思え、考え中です。 ちなみに、ヒトの細胞はシングル化が可能かを調べていないので、ペアレンタル細胞をいちどクローニングしてみます。 （濃く撒いたときと薄く撒いたときにコロニーの形成パターンが明らかに変わるため、クローン化に対して少し心配しています。） ところで、Crispr/casとTALENでは、どちらがより扱いやすいかをご存知であれば、教えていただきたいです。 （別トピックを作製しなければならなければ、この場で質問してすみません。）

(無題) 削除/引用 No.2915-8 - 2014/03/26 (水) 06:52:28 - asan shRNAとsiRNAの配列は全く同じ配列だと動かないことはあるので、必ずしも相関しません。一応コンバージョン出来る場合もありますが。 一般的には、shRNAはsiRNAに比べてマルチプルインテグレーションしなくては機能しない場合が多いので、ウイルスで行う場合でもタイターを上げて初めて十分なノックダウンができる場合も多いです。というのは、mRNAの分解と合成の競争になるので、過剰発現のように1コピーでどんどんでてくるのとは違うという点やプロセシングをうけて機能的にダイサーに組み込まれるまでの不安定性による影響などで発現が十分にならない場合もあるからです。 配列がよくない場合は濃縮しても無駄です。配列がいい、あるいはそれがまあ限界という場合は、タイターをあげたり複数インフェクションしてMOIを上げるのが一般的です。他の方法としては一つのコンストラクトに複数のH1-shRNA配列-ttttttのをもつコンストラクトを設計するのもありあます（最大6つぐらい）。配列がだめな場合は関係ないですが。 ラボにウイルスの系がなければ、個人的にはCrispr/casが多分一番手っ取り早いと思います。片アリル潰す（50%）ならかなり簡単ですし、ノックアウトでもそれなりにうまくいきます。リポフェクションでステーブルラインを作っているならあまり操作は変わりませんし、シングルコロニー化に弱い細胞でなければ最短1ヶ月ぐらいあればつくれます。コストもそんなにかかりません。

(無題) 削除/引用 No.2915-7 - 2014/03/25 (火) 20:11:59 - モモ シングルクローンを取っていないなら、クローンにすることでKDの強い株も得られますよ。

(無題) 削除/引用 No.2915-6 - 2014/03/25 (火) 20:08:04 - モモ ウイルスを使ったらトランスフェクションよりKDの強い細胞が得られやすいです。今お使いのコンストラクトがウイルスベクターとしても使えるなら試してみるとよいと思います。

みなさんありがとうございます！ 削除/引用 No.2915-5 - 2014/03/25 (火) 18:15:58 - mine こんなに早くのご回答をありがとうございます！ ぺーぺーさん ゲノム編集については視野に入れているのですが、現在行っている方法では、どうしてもうまく行かないときに用いようと考えています。 発現量の問題であると思い至った理由は、siRNAでのノックダウンでうまくノックダウンされることを確認した配列を、shRNAベクターに組込んでいるためです。 配列も７パターン試し、その中でノックダウン能にいくらかの差はあることも確認しました。 その差が配列依存的なノックダウン能の差と考えました。 しかし目的の遺伝子に対するノックダウン能が、実験に用いたいレベルには到底及ばない低さであったため、そもそもshRNAの発現量が目的の遺伝子をノックダウンできるほどは発現していないのではないかと考えました。 おおさん リポフェクション導入後48時間でのノックダウン能はほぼありませんでした。 その後、拡大培養と薬剤セレクションを行い安定株としています。 しかし、実は、siRNAノックダウンでもリバーストランスフェクションを行わないと目的の遺伝子はノックダウンされないので、正しくは、一過性でのノックダウン能は調べていません。 いちど、shRNAベクターをリバースでトランスフェクションした場合の一過性ノックダウン能を観察してみます。 ~さん 誘導性のベクターは検討したことがありませんでした！ これまで報告されている知見から、増殖には関係ないだろうと考えていました。 一過性ノックダウンを行った結果を見て、誘導性ベクターも検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2915-4 - 2014/03/25 (火) 14:32:37 - ~ もし、一過性発現ではよくKDされているようであれば、 ターゲットの遺伝子が増殖にプラスに働くのかもしれませんね。 その場合、誘導性shRNA発現ベクターがつかえるかもしれませんね。 私は使ったことがないのでどのくらいうまく誘導できるか分かりませんが。

(無題) 削除/引用 No.2915-3 - 2014/03/25 (火) 11:25:26 - おお 長期のノックダウン効果ということなので安定導入株をとってからKDされているか見てるんだろうと思いますが、そのプラスみドの一過性の発現ではKDはどの程度でしょうか?

(無題) 削除/引用 No.2915-2 - 2014/03/24 (月) 23:43:24 - ぺーぺー 二点疑問があります。因みに培養系は少ししかやったことがないので、お力になれるかは謎ですが。 ・ノックダウンじゃなくてはならない理由があるのですか？つまり、はやりのゲノム編集という手もありそうな気がします。 ・shRNAの発現量が少ないと疑う理由は？多くの場合、ノックダウンの効率がイマイチの場合は配列を疑うと思いますが。

shRNA安定株作製について 削除/引用 No.2915-1 - 2014/03/24 (月) 17:50:38 - mine ほ乳類細胞（ヒト、イヌ）shRNAノックダウン株を作製しています。 長期のノックダウン効果を観察したいため、siRNAで効果のあった配列を使用してshRNAベクターを作製し、細胞に導入しました。 プロモーターはH1プロモーターを用い、リポフェクション法で導入しています。 現時点で得られているノックダウン株は、非常にノックダウン能が低く、 （少量はノックダウンされている）あまりノックダウンされていないように見受けられます。 shRNAの発現量を増やしたいと考えていますが、皆さんのお知恵をお貸しください。 また、ノックダウン安定株のを作製する際に、高ノックダウン株を得るコツをお持ちの方がいらっしゃいましたら、どうか教えてください。 どうぞよろしくおねがいします。

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