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(無題) 削除/引用 No.2970-16 - 2014/04/16 (水) 02:10:41 - L ウエスタンで消失するという事は、免染でのバックグラウンドの問題が先ですね。一次抗体を抜いた染色で二次抗体によるバックグラウンドはどうですか？ 二次抗体だけではシグナルがなく、一次抗体と入れるとシグナルが出て、吸収後の一次抗体でも同等のシグナルが出る、という事だと、吸収後の一次抗体溶液に何が残っているのか、という問題になりますね。非特異のクローンが混じっているならば、おおさんの言うように、ノンスペの吸収を試してみるのも手と思いますが、ウエスタンではシングルバンドとの事なので、、、、

(無題) 削除/引用 No.2970-15 - 2014/04/16 (水) 01:04:48 - おお ちょっとフォローしてないところがありますが、ノンすペを吸収という手もありますね。。。

(無題) 削除/引用 No.2970-14 - 2014/04/16 (水) 00:52:10 - ああ ウェスタンでは消失します。アセトン処理とはどういう意味があるのでしょうか？タンパクはリコンビナントを使用しているのですが。

(無題) 削除/引用 No.2970-13 - 2014/04/15 (火) 23:55:57 - おお >>[Re:10] Lさんは書きました : >> WBで確認済みというのは、WBで出るシングルバンドが抗体の吸収により消失する事を確認したのか、消失しない事を確認したのか、はっきりしないですね。 >> >(以下略) >同感。私も書こうと思っていたことを言ってくださいました。 同感。私も書こうと思っていたことを言ってくださいました。

(無題) 削除/引用 No.2970-12 - 2014/04/15 (火) 22:36:56 - AP >[Re:10] Lさんは書きました : > WBで確認済みというのは、WBで出るシングルバンドが抗体の吸収により消失する事を確認したのか、消失しない事を確認したのか、はっきりしないですね。 > (以下略) 同感。私も書こうと思っていたことを言ってくださいました。 >抗体原液とタンパク溶液を一定時間混合させるだけで、その後抗体希釈液で薄めて遠心後、染色に用いるという操作です。他にも何かコツがあるのでしょうか? それでうまく行く場合もありますが、いったんタンパク質溶液をアセトン沈殿して、再懸濁したものを使ってみては

(無題) 削除/引用 No.2970-11 - 2014/04/15 (火) 22:24:00 - 通りすがり 吸収の過程で、抗原抗体反応のあと遠心してるけど、これは抗原抗体コンプレックスを落とす目的？　であれば、それなりの処理を抗原にしてあるのかな？　もし抗原抗体コンプレックスが上清中にあるのなら、考えるべきは抗体とリコンビナント抗原の比ではなく、組織切片に存在する抗原量と、吸着で用いたリコンビナント抗原の量の比ではないかな？　専門じゃないから確かじゃないけどね。

(無題) 削除/引用 No.2970-10 - 2014/04/15 (火) 21:51:40 - L WBで確認済みというのは、WBで出るシングルバンドが抗体の吸収により消失する事を確認したのか、消失しない事を確認したのか、はっきりしないですね。 前者なら、単純に免疫染色では非特異のシグナルを見ているという事でよいのでは？　免疫染色は、組織切片か何かで、epitope retrievalして、一次抗体の反応後、蛍光標識の２次抗体で染めているのですか？　それともビオチン化抗体を挟んでシグナルを増幅しているのでしょうか？ 後者ならば、リコンビナントのタンパクをどう作って精製しているのか、１０倍量というのは、モル比なのか質量比なのか、これらの情報があった方が答えやすいですけど、どうなんでしょう？

(無題) 削除/引用 No.2970-9 - 2014/04/15 (火) 19:27:26 - ああ ありがとうございます。ウェスタンでは確認しています。吸収試験の操作と仰いますが、抗体原液とタンパク溶液を一定時間混合させるだけで、その後抗体希釈液で薄めて遠心後、染色に用いるという操作です。他にも何かコツがあるのでしょうか？ また、抗体と抗原タンパクの比率は皆様どのようにされていますか？

(無題) 削除/引用 No.2970-8 - 2014/04/15 (火) 17:57:25 - qw 基本的には吸収実験をうまくやっていないだけに思えます。 吸収できていないことを免疫染色の結果だけで評価することは困難です。 吸収させた抗体で、ウェスタンが出ないことを確認してありますね？ それでウェスタンが出るようであれば、それなりの考えもあるでしょうし、出ないのであれば、免疫染色の操作に別の問題があるでしょう。 リコンビナント抗原を適当なビーズに固定化できると、もっとすっきりするかも知れませんが、そこまでしないだろうね。

(無題) 削除/引用 No.2970-7 - 2014/04/15 (火) 11:25:09 - TS 抗原は、バクテリアか何かで作ったまま、ということですか。 賦活化しないと免染できない抗体であれば、賦活化のようにフォールディングをほぐしたりしないと、認識部位に到達できていないとか考えられませんか。 賦活化と同様の処理をした抗原を使ってみるとか。

(無題) 削除/引用 No.2970-6 - 2014/04/15 (火) 11:06:14 - ああ 皆様ありがとうございます。 抗体は抗血清ではありません。シグナルというのは免疫染色で2次抗体での反応をかけたところ、 蛍光が吸収試験区では消失しない、という意味です。賦活化はかけています。 WBでは発現しているとされる細胞において、目的の分子量の位置にシングルバンドを検出した、ということです。この位置と同じ位置に今回の標的でもバンドが検出されたことから、抗体がworkしている、と判断しています。 エピトープ情報がどうしても非開示ということなので、 全長を発現させて吸収試験を行っているのですが、 全長で行った場合と、エピトープをカバーする短いペプチドを用いたときでは結果に差異が生じるのかという点が気になっているのです。

(無題) 削除/引用 No.2970-5 - 2014/04/15 (火) 10:23:28 - おお あ、WBでは確認してると書いてる。。。けど何をかくにんしたのだろう。

(無題) 削除/引用 No.2970-4 - 2014/04/15 (火) 10:21:25 - TS 抗原の構造によって認識部位がマスクされているとか。 文章からは少しわかりにくいですが、免疫染色でシグナルが消えないということでしょうか。 そうだとして、免疫染色のサンプルは賦活化とかはしてないのですか。 確かに本当に、他の関係ないたんぱく質が染まってしまっている可能性もあるわけですが。 qwさんも触れていますが、抗体の精製方法とかもヒントになるかも。 一部のエピトープを使っていれば、そのペプチドなら吸収できるかな。

(無題) 削除/引用 No.2970-3 - 2014/04/15 (火) 10:11:16 - qw 市販ポリクロ抗体は、そもそも抗原アフィニティーカラムで精製してあるのかな？ ただの抗血清の可能性はないですよね？？ ＞リコンビナント抗原を抗体の10倍量加えていますが、シグナルが消えません。 どうやって、何のシグナルを見ているのか、よくわかりませんね。 操作上の誤解の可能性もあるので、詳細な記述が必要ではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2970-2 - 2014/04/15 (火) 07:34:56 - おお その抗原を適量SDSPAGEに流し、WBでワークしているか確かめることもできるんじゃないか。

吸収試験 削除/引用 No.2970-1 - 2014/04/15 (火) 01:47:02 - ああ 市販ポリクロ抗体の吸収試験をしています。作成したリコンビナント抗原を抗体の10倍量加えていますが、シグナルが消えません。反応は室温一時間です。またウェスタンでは確認しています。この場合は、抗体が認識しているものは非特異という結論になるのでしょうか？タンパク全長より、ペプチドの方が好ましいとの文献もあり、経験豊富な皆様のお力をお貸しください。

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