8 well Chamber Slide上でトランスフェクションを行っている方、どのようにしているか教えて頂けますでしょうか? よろしくお願いします。
8 well Chamber Slide上でトランスフェクションを行う際に、もっと大きいサイズのwellでやる場合のスケールを元に、スケールダウンした容量で試してみました。具体的には、マニュアルでは6wellプレートのうちの1well(9.4平方cm)に対して、
FuGene6を3ul, DNAを1ug, FuGene6とDNAのコンプレックスが100 ul、トータルのメディウムが2 mlとあるので、
8 well Chamber Slideの1well(0.7平方cm)に対して、
FuGene6を0.2ul, DNAを0.07 ug, FuGene6とDNAのコンプレックスが7.4 ul、トータルのメディウムは計算上は0.15 mlになるがこれで6時間培養したところwell中央の細胞が乾いてしまったので、これは300ul上げて0.18mlで、試してみました。
結果、どうも、6wellプレートではうまくいくトランスフェクションが、8 well Chamber Slideではうまくいっていないようなのです。
使っている発現ベクターは、IRESによって、見たい遺伝子とDsRed2の両方を発現するようになっています。これを6 well plateでのトランスフェクションをマニュアルに従ってCOS7細胞に行い、2日後にこの細胞からタンパク質を抽出して、見たい遺伝子に対する抗体でウェスタンすると、非常に強い発現(10 ugのタンパクを流して、普通のECLを使い、5秒のexposureでフィルム上に非常に太いバンドが現れる位、とかけばわかっていただけるでしょうか?)を確認できます。
このベクターを8 well Chamber Slide上にまいたCOS7細胞に上記の方法でトランスフェクションし、DsRed2の蛍光で、遺伝子がきちんと入った細胞を見分けられるか試しました。 トランスフェクション2 または 3日後に、2% パラフォルムアルデヒドで30分固定後、Prolong Gold anfifadeでマウントしたスライドを蛍光顕微鏡で見てみました。
DsRed2が発現している細胞は赤色蛍光で確認できたものの、その数は非常に少ないという結果になりました(5〜10%の細胞のみ赤色蛍光を発している)。
全く赤色蛍光が見られないわけではないので、見たい遺伝子のみ発現してDsRed2は発現していないというベクターの問題があるとは考えにくいと思っております。また、ウェスタンの結果、およびCOS7が非常にトランスフェクションしやすい(と言われている)細胞であることを考えると、トランスフェクション効率が10%以下というのはいかにも少ないと思っています。
使ったDNAの量が非常に小さく、あるいはチューブに吸着したのが問題かと、トランスフェクションコンプレックスは最大で8倍量で作ってみて試してみましたが、結果は変わりませんでした。
トータルのメディウム量を変えてしまったので、そのトータルのメディウム量に合わせてFuGene6とDNAの量を増加させて試してもみましたが、これもうまくいきませんでした。
小さいサイズのウェルでトランスフェクションがうまくいっている方、どのように行っているか教えて頂けますか?よろしくお願いします。
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