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WB用サンプル調製 トピック削除
No.3045-TOPIC - 2014/05/19 (月) 11:38:32 - kana
誰かご存知の方がいらっしゃいましたら、どうか御教示頂けないでしょうか。

今度、初めてラットの肝組織を用いて、あるタンパクをウエスタンブロッティングで検出を試みたいと思っています。実験室の整理をしていたところ古い電気泳動セットが出てきたところ、免疫染色用の抗体を用いれば何かしら出るんじゃないかと言われました。そこでサンプルの調製法についていろいろ調べてみたのですがいろいろな方法があって良くわかりません。
とりあえず、流れとして
臓器を細かく切ってTris-HClで洗浄する。
Oniceでしたガラス製ホモジナイザーにサンプルを入れ、Protease inhibitorを添加したTris-HClでﾎﾓｼﾞﾅｲｽﾞする。このときサンプル10ｇあたり0.5mLのProtease inhibitorを添加。臓器の5倍量のバッファーでホモジナイズする。その後遠心（15000ｇ、10分）し上清を採取し-80℃保存。この上清でタンパク定量する。上清を10%SDS、ショ糖、0.5%ﾌﾞﾛﾓﾌｪﾉｰﾙﾌﾞﾙｰからなるバッファーに混和し2-MEを加えて5分過熱しSDS化する。
以上の工程を考えています。またホモジナイズするバッファーにDTTやPMSFを添加する必要はあるのでしょうか？このままではＷＢを行うことはできないでしょうか？どなたかご意見ください。
　
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No.3045-4 - 2014/05/19 (月) 12:39:47 - mem
すみません、追加です。
界面活性剤が入ってる場合は、ホモジナイズよりソニケーションの方がよいかもしれません。
また、細かくした組織であれば、ピペットだけでも結構溶けます。

抗体が使えるかは、データシートを参照して下さい。

(無題) 削除/引用
No.3045-3 - 2014/05/19 (月) 12:35:19 - mem
見たいタンパク質が膜、核内、細胞質のどこに存在するかで用いることができるバッファーは異なります。Tris-HClだけでは、界面活性剤が入っていないので膜タンパク質はとれないでしょう。また、細胞質のタンパク質が目的だとしても、生理的な塩濃度にしたほうがよいと思います。
目的のタンパク質のWBを行っている論文を探して、バッファーを決めるのが一番確実です。
汎用的なものであれば、RIPAやNP40/TritonX100のバッファーがあります。
ホモジナイズの際はDTTは普通は必須ではないです。

界面活性剤が入っている場合のタンパク質定量は、許容濃度以下になるように希釈するよう注意が必要です。
サンプルバッファーは、Laemmli系が一般的ですが、Tris-HCl（pH6.8）をお忘れなく。

図書館でも本屋でもよいので、一度プロトコールに目を通す事をお勧めします。
もしくは、各社の電気泳動槽のマニュアルにも方法が書いてるので、参考になるでしょう。

ただ本をみるだけではイメージがわかないと思うので、近くの研究室で実際にみせてもらうのがよいと思います。

(無題) 削除/引用
No.3045-2 - 2014/05/19 (月) 12:13:25 - yamazaru
もう少し状況を整理されたらいかがでしょうか？
ウェスタンブロット自体はできると思いますが、ウェスタンブロットをするには、電気泳動装置だけではなく、トランスファー装置も必要です。

DTTは、2-MEと同様の作用を期待して代わりに入れることがありますが、2-MEがあれば入れなくてもよいです。PMSFもprotease inhibitorの１つですので、カクテルをいれるのであれば、基本的には不要です。

SDS、2-MEの作用を受けているため、免疫染色用抗体で検出できない場合もありますが、うまくいくと良いですね。

１）臓器を細かく切ってTris-HClで洗浄する。
２）Oniceで、冷やしたガラス製ホモジナイザーにサンプルを入れる。
３）サンプル10ｇあたり0.5mLのProtease inhibitorを添加する。
４）サンプルの5倍量のバッファーを加える。
５）ホモジナイズする。
６）遠心（15000ｇ、10分）し上清を採取し-80℃保存
７）上清をタンパク定量する。
８）上清を10%SDS、ショ糖、0.5%ﾌﾞﾛﾓﾌｪﾉｰﾙﾌﾞﾙｰからなるバッファーに混和し2-MEを加えて5分過熱しSDS化する。

初めてなら、−80度保存は避けたほうが良いと思います。
ﾌﾞﾛﾓﾌｪﾉｰﾙﾌﾞﾙｰが濃すぎると思います。

WB用サンプル調製 削除/引用
No.3045-1 - 2014/05/19 (月) 11:38:32 - kana
誰かご存知の方がいらっしゃいましたら、どうか御教示頂けないでしょうか。

今度、初めてラットの肝組織を用いて、あるタンパクをウエスタンブロッティングで検出を試みたいと思っています。実験室の整理をしていたところ古い電気泳動セットが出てきたところ、免疫染色用の抗体を用いれば何かしら出るんじゃないかと言われました。そこでサンプルの調製法についていろいろ調べてみたのですがいろいろな方法があって良くわかりません。
とりあえず、流れとして
臓器を細かく切ってTris-HClで洗浄する。
Oniceでしたガラス製ホモジナイザーにサンプルを入れ、Protease inhibitorを添加したTris-HClでﾎﾓｼﾞﾅｲｽﾞする。このときサンプル10ｇあたり0.5mLのProtease inhibitorを添加。臓器の5倍量のバッファーでホモジナイズする。その後遠心（15000ｇ、10分）し上清を採取し-80℃保存。この上清でタンパク定量する。上清を10%SDS、ショ糖、0.5%ﾌﾞﾛﾓﾌｪﾉｰﾙﾌﾞﾙｰからなるバッファーに混和し2-MEを加えて5分過熱しSDS化する。
以上の工程を考えています。またホモジナイズするバッファーにDTTやPMSFを添加する必要はあるのでしょうか？このままではＷＢを行うことはできないでしょうか？どなたかご意見ください。
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