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(無題) 削除/引用 No.313-7 - 2012/03/21 (水) 15:29:55 - SS 皆様、ご意見ありがとうございます。 う様 ご指摘の通り、タンパクAにタグをつけずに共発現させたタンパクB、タンパクCで落としてみようと思います。現在私が考えている仮説が「細胞質に入ってきたタンパクCをタンパクAがdetectし、それによりタンパクBとの結合が増強する」といったものを考えているのでタンパクAで免疫沈降できればと考えていたため、どうにかタグを付けようとこだわってしまいました。 ab様 翻訳後修飾でC末端が切断されるようなvariantの報告はないようです。また終止コドンが入っていないことも確認しております。やはりGFPを付加することは望ましくないようですね。ご指摘の通り、免疫沈降ならともかく、ウエスタンの時までタグを検出できないということに違和感があったためにご意見頂きたく今回質問させて頂きました。 Harmonia様 すみません、FLAGにより移動度が影響されるというのは初耳でした。実際に確認したのはタンパクA-Mycのみです。タンパクA-Mycと空ベクターをそれぞれHEK293T細胞にトランスフェクションし、whole cell lysateをウエスタンブロットで検出しました。細かい分子量の変化はわかりませんでしたが、およそ80kDaの位置にタンパクA-Mycを流したレーンにのみバンドを認めたことからタンパクAは発現していると判断いたしました。 Q様 説明が足らずご迷惑をお掛けしました。終止コドンについてはいずれのベクター構築時に制限酵素サイトに置換してつぶしています。また翻訳後修飾についての報告はないのですが、翻訳後修飾が起きていないかについても検討していきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.313-6 - 2012/03/21 (水) 08:58:21 - Q 前の書き込みで、描き忘れました。 切断されるとか、修飾されるとか、STOPとかが入っているとか、そこら辺はちゃんとチェックしているというところから始まらないと、議論以前にケアレスミスがどうとか話がややこしくなりすぎますが・・・。

(無題) 削除/引用 No.313-5 - 2012/03/21 (水) 08:55:47 - Q ＞例えば、タンパク質Aは翻訳後修飾でC末端が切断されること（あるいはvariantの存在）はないですか？ また、ありえないと思いますが、PCRなどで増やした際にタグの前にstop codonが入ってしまったとか

(無題) 削除/引用 No.313-4 - 2012/03/21 (水) 08:10:54 - Harmonia タンパクA-Myc、タンパクA-HA、タンパクA-FLAGのそれぞれはタンパクAに対する抗体で検出できているということですが、それぞれの移動度は期待される位置ですか？とくにFLAGは遅いほうに引っ張られる傾向がありますが、そうですか？

(無題) 削除/引用 No.313-3 - 2012/03/20 (火) 07:29:25 - ab あくまで可能性として。 例えば、タンパク質Aは翻訳後修飾でC末端が切断されること（あるいはvariantの存在）はないですか？ また、ありえないと思いますが、PCRなどで増やした際にタグの前にstop codonが入ってしまったとか。 もし、C末端タグが検出できない原因が構造的なものであれば、GFPなどの大きいタグだとさらに構造が変化してしまう可能性があるので、あまり機能解析には向いていない気がします。 そもそも、western blottingではタンパク質の高次構造はかなり崩れているので、検出できないのは構造的な問題よりも他の原因であるように感じます。 タンパク質内部へのタグの付加もドメイン構造がわかっていればよいのですが、そうでなければ難しいのではないでしょうか。 それぞれのタンパク質のcDNAを持っているのであれば、大腸菌で発現させて精製したタンパク質で結合実験をした方が結果が見やすいように思います。もちろん、その後で細胞を用いた実験をすべきだと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.313-2 - 2012/03/19 (月) 16:41:13 - う ま基本的にやってみないとわからないという 類いのことだと思っていますが、 ひとつよくわからないことがあります。 B-Aは結合する A-Cも結合する（新たな発見） SS様曰く ＞タンパクAとCの結合がタンパクAとBの結合にどのような影響を与えるかを免疫共沈で確認しようとしています。 それならば、最初はAにタグなどつけずに、 タグをつけたBとCを使ってAが落ちてくるか Cを落としたときに、Bが同じく落ちてくるのか とかを調べるとかがいいような気がします。

C末端に付けたタグ 削除/引用 No.313-1 - 2012/03/19 (月) 11:37:05 - SS いつも勉強させて頂いております。 ある80kDa程度の分子量を持つタンパクAについて研究しています。 タンパクAはN末端でタンパクBと結合することが複数の論文で報告されています（データは主に免疫染色による共局在）。 今回私はタンパクAのC末端側に結合するタンパクCを同定したため、タンパクAとCの結合がタンパクAとBの結合にどのような影響を与えるかを免疫共沈で確認しようとしています。 FLAG-タンパクA、V5-タンパクBといったようにN末端にタグを付けたタンパクを強発現させて免疫共沈を行いましたが、タンパクAとBの結合は確認できませんでした（複数の細胞株で確認しました）。 結合部位付近にタグがあることが問題と考え、タンパクA-Myc、タンパクB-HAとC末端にタグをつけたベクターを構築しました。ここで問題が生じたのですが、タンパクA-Mycの発現が抗Myc抗体を用いたウエスタンブロットで確認できませんでした。 次にタンパクA-HA、タンパクA-FLAGとタグを変えてみましたが、いずれもタグの抗体で発現を確認できませんでした。タンパクAに対する抗体でリブロットをしたところ、タンパクA自体は発現しているようでした。 また、他のタンパクでC末端に同様のタグをつけた際は問題なくタグの抗体で検出できているので抗体の問題でもなさそうです。 このことから、タンパクAの構造上C末端のタグが認識されにくい場所に潜り込んでしまっているのではないかと考えています。市販されているタンパクAの抗体はタンパクBとの結合部位を認識しているため免疫共沈には使用できず、なんとかタグをつけて対応したいと考えています。 対策として以下のようなものを考えています。 �@GFPのような大きなタグをC末端につける �AC末端からさらにリンカーを挿入してからタグを付ける �Bタンパクの真ん中にタグを挿入する 以前タンパクAをN末端につけて細胞内局在を確認した時に、タグなしのタンパクAと比較して局在が変わっている気がしたので、GFPタグにはあまりいい印象がないです。 同じような経験をされ、�@〜�Bの対策をして成功したというご経験があればご教示いただきたいと思います。 長文でわかりにくいところもあると思いますが、ご回答のほどよろしくお願いいたします。

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