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(無題) 削除/引用 No.3169-13 - 2014/07/01 (火) 09:00:33 - AP いまから20年も前の情報ですしね。業界全体的に品質は向上してきているので、今でもそういう事（DNAの変性）があるのかどうか、私は懐疑的です。 それに線形のDNA断片はともかく、基本CCCのプラスミドですからねえ。意図的に変性しようと思ってもなかなかいかないものです。 吸着の問題は、希釈したプライマーとかRT-PCRの鋳型の希釈列とか、いまでもクリティカルで、それなりの対処が必要な場面が多いですが。

(無題) 削除/引用 No.3169-12 - 2014/07/01 (火) 01:11:28 - おお >[Re:9] 通りすがりさんは書きました : > おおさん、意外です。よく知られてるのかと思ってました。古いDNAストックや消化断片でこういう現象はたまに見ます。 > Avoiding DNA loss and denaturation upon storage in > plastic microtubes > でグーグルすればpdfが出て、それに詳しいですが、 > Polypropylene Tube Surfaces May Induce Denaturation and Multimerization of DNA > Science 12 January 1996: 222. > のコメントと、それへのレスポンスに議論があり、 > Biopolymers. 1999 Dec;50(7):679-89. ありがとうございました。たぶんいつも再現性があるというはなしではないので、メジャーにならないんでしょうね。濃度とも関係があるかもしれません。通常保存する濃度は壁に接触しているDNAより大過剰あると思いますし。PPの製造過程で入るものもなにか原因になっている可能性があるのかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.3169-11 - 2014/06/30 (月) 23:42:46 - 中年 いやいや、まずは切断前の泳動パターンがどう変化しているかを確認するところからでは？

(無題) 削除/引用 No.3169-10 - 2014/06/30 (月) 22:52:10 - としお ありがとうございます。 容器によってこんなに差がでるとは驚きです。 とりあえず重要なサンプルは小分けにしていくつか保存するしかないようですね。苦労して作ったのにいざ使おうとしてだめだと分かった時のショックは大きいですから・・・

(無題) 削除/引用 No.3169-9 - 2014/06/30 (月) 13:33:56 - 通りすがり おおさん、意外です。よく知られてるのかと思ってました。古いDNAストックや消化断片でこういう現象はたまに見ます。 Avoiding DNA loss and denaturation upon storage in plastic microtubes でグーグルすればpdfが出て、それに詳しいですが、 Polypropylene Tube Surfaces May Induce Denaturation and Multimerization of DNA Science 12 January 1996: 222. のコメントと、それへのレスポンスに議論があり、 Biopolymers. 1999 Dec;50(7):679-89. で短いDNAの場合のデータもあります。X-shaped, T-shaped DNAの電顕もありますが、原因は特定できたわけでないようです。このあとのフォローが見つかりません。チューブ表面の疎水性によってDNAの対合が乱されて（塩基は疎水的なので）、一本鎖になることがきっかけなのかと、漠然と思ってました。 明らかにチューブの材質が問題なので、BMのプラチナチューブなどを使ったこともありますが、結局、それほど高い頻度で起きる現象ではないので、それで改善されたのかどうか、はっきりしないまま、いつのまにか普通のチューブに戻しました。 他の方で情報をお持ちでしたらお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3169-8 - 2014/06/30 (月) 08:53:31 - ~ 1年前の保存もご本人がされたのでしょうか？ 前任者が保存したものを使おうとしたら、中身とラベルがあっていなかったという話は耳にします。

(無題) 削除/引用 No.3169-7 - 2014/06/30 (月) 05:08:34 - おお >[Re:6] 通りすがりさんは書きました : > それって、600bpくらいのバンドだったりしませんか？それだとDNAがプラスティック表面で変性したものの可能性があるかと。 これについて詳しく教えてください。PPは長期保存によくないということでしょうか。おそらくほとんどのラボがPPをつかっているとおもいますけど。もしそうならどんな材質がいいのでしょうか。 あと質問にたいしてですが。 いんたくとなプラスミドにニックが入るだけでも(制限酵素処理しないばあい)バンドパターンがかわります。 制限酵素処理しているばあいだと、partial digestionの結果かもしれません。 ニックがはいっているという状態ならスメアーになってなければそんなにひどい状況でもないので(ケースバイケースで、あまり科学的な評価でありませんが)、大腸菌に入れ直して増やしなおすといいかと思えます。

(無題) 削除/引用 No.3169-6 - 2014/06/30 (月) 00:05:46 - 通りすがり それって、600bpくらいのバンドだったりしませんか？それだとDNAがプラスティック表面で変性したものの可能性があるかと。

(無題) 削除/引用 No.3169-5 - 2014/06/29 (日) 23:24:35 - としお ありがとうございます。 多くの場合は大丈夫なのですが、同じプラスミドでもなぜか余分なバンドが出たり、サイズが異なっている場合があります。 プラスミドはキットで精製後ＴＥに溶かし、目的物であることは確認しています。保存中に切断反応は起こりうるものでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3169-4 - 2014/06/29 (日) 23:03:38 - AP 保存中にランダムなせつだんが起こっているのかも。 いったん大腸菌に戻して精製しなおせば、

(無題) 削除/引用 No.3169-3 - 2014/06/29 (日) 20:28:20 - 中年 ボスがポスドク時代に調製したという年代物のプラスミドのストックを分けて貰って使ったことがあります。20年近く前のものでしたがcccの割合もそれほど遜色なく、まったく問題なく使えました。 切断パターンが変わっていたとのことですが、そもそも切断前の泳動パターンはいかがでしたか？

(無題) 削除/引用 No.3169-2 - 2014/06/29 (日) 17:45:07 - papa バッファーがTE bufferなら，1年やそこらで変になったことはないですが。 水の場合にはスメアになり，分解されたことはあります。

プラスミドの保存について 削除/引用 No.3169-1 - 2014/06/29 (日) 17:26:54 - としお プラスミドを１年ほど-20℃で冷凍保存したのち使おうと思って制限酵素チェックをして調べてみたところ、切断パターンが変わっていました。 プラスミドは冷凍保存してもあんまりもたないものなのでしょうか。 長期間安定に保つ方法がありましたらご教示ください。 よろしくお願いします。

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