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(無題) 削除/引用 No.3176-8 - 2014/07/02 (水) 14:54:37 - おお 2ug/ulで調整することで検出に困るかどうかは実験やシステム次第なんですが、、、濃度としては無難な濃度ですね。まんまるの細胞などで通常の蛋白発現をみるwesternならばそれぐらいでまずはやればいいかと思います。私の場合はもうちょっと薄い場合が多いですが、でも実験によります。 どなたか指摘が会ったと思いますがsample bufferを加える前のバッファーの持ち込みの量が変わるとそれが影響する場合もあります。 300mMのNaClを含むバッファーで蛋白濃度に2倍さがあって、片方は4ulもう一方は8ul入れたとして塩濃度の違いがこんどは倍になってしまう。これもえいどうを乱す原因になりえます。塩だけでなくバッファーも要因になり得ますから(えいどうのバッファーと拮抗したりとか)、絶対とまでいいませんけど注意、または気に留めておいた方がいいかとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.3176-7 - 2014/07/02 (水) 11:42:29 - うえすたん サンプル調製はする癖つけたほうがいいです。 各タンパク量を測定後、sample buffer(5xや2xなど)とMQ、タンパク液を混ぜて1もしくは2ug/ulになるように調整しておくことをお勧めします。 なぜこのようなことをするかというと、SDS-PAGEで等量流さないとバンドがキレイに流れなかったりゆがんだりします。ですのでロードするサンプルの濃度を均一にしておくべきなのです。一般的に2ug/glで調整することで検出に困ったことはありません。

(無題) 削除/引用 No.3176-6 - 2014/07/02 (水) 10:58:45 - おお 影響でることがけっこうあります。レーンが太ったりほそくなったり。 濃度をそろえてからの方がいいと思います。 それと50ugで1ulですか? その量だとsample bufferのSDSの量が蛋白に対して不足して完全にへんせいできていないとおもいます。せめて5ulぐらいにならないと、、、それでもけっこう濃いという印象が、、、SDSがはいっているにもかかわらず、ボイルすると蛋白が沈殿しそうなのうどです。 また1ulを正確にピペットでとるのも難しいし、大きな誤差を拾う可能性があるとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.3176-5 - 2014/07/02 (水) 10:54:33 - qw ＞1wellあたり50μgの総タンパクとなるようにしていたのですが、 ＞そうするとwellへのアプライ量が1μLほどになるサンプルがでて 電気泳動・CBB染色してみて、本当にそのような濃度だったのか、確認するほうが安全かもしれません。 50mg/mlのタンパク試料は、予想を絶して濃いですよ。１gの組織中に、200mg程度のタンパク質があります。これが全て4mlに抽出される条件は、大層困難です。 試料調整上、本当にそのような高濃度の試料を調整されたのかもしれませんが、もしかして、タンパク定量を失敗していませんか。 サンプルバッファーがfinal２％SDSだとして、1ulのサンプル中には20ugのSDSが含まれています。一般的に、SDS量はタンパク質重量程度を必要としますから、50ugのタンパク質を全て良好にSDSすることが困難でしょう。本当にその濃度であるのなら、サンプルバッファーで適切に希釈する必要があります。

(無題) 削除/引用 No.3176-3 - 2014/07/02 (水) 10:22:12 - ｃDNA emaさんのご指摘の内容は、条件を一定にということもあるけど、サンプル量、サンプルのバッファー組成を同じにすることで、そもそも電気泳動自体がきれいに流れます。 こだわるならマーカーのバッファーも同じ組成に近づけて、サンプルの外側などの何もアプライしないレーンにも同じ組成でタンパク無しのものをアプライしておくと、電気泳動のゆがみがかなり減ります。 いつもきれいな電気泳動を心がけておくと、発表用に慌てて実験のやり直しなどが極力減らせるので、お勧めです。

条件を一定にするために 削除/引用 No.3176-2 - 2014/07/02 (水) 10:14:29 - ema ＞1wellあたり50μgの総タンパクとなるように 計測した時点ではタンパク定量に邪魔だからLoadBufferとかが入ってないこともありますよね。計測し液量がばらばらでそのあと入れるLoadBuffer（グリセロールとか入っていて粘度比重が重ため）量もそれに比してばらばらだとあるレーンでは多い隣に引きずられることがあります。 単に1バンドしかでなくて少しずれていてもというアバウトな系ならいいのですが、リン酸化でシフトするだの短くなるだの検出では間違った解釈を生む実験系になります。 私は最初に先輩から習ったのは タンパクを計測した時点ですべてのサンプル液量が同じになるようにLysisBufferを足りないものは加えて、というかどの"実験"も1well 20uｌとかルール決めしてLoadBuffer量も同じ（もしサンプル無くて空いているレーンもLysis+LoadBuffer量は端から端まで同じ状態で流す ＞サンプルバッファーや2-MEなどで加熱しSDS化 は溶解したタンパクを処理したいだけなのでLysis+LoadBufferMixの追加分は特に加熱しなくても大丈夫です。

ウェスタンブロットのサンプル調製について 削除/引用 No.3176-1 - 2014/07/02 (水) 09:44:52 - ^^ 現在ウェスタンブロットで総タンパク量の調整をしています。 1wellあたり50μgの総タンパクとなるようにしていたのですが、 そうするとwellへのアプライ量が1μLほどになるサンプルがでてきました(他のものは5-10μL程度)。ここで質問なのですがwellへのアプライ量が少ないとバンドの出方に影響はあるのでしょうか？ またサンプルバッファーや2-MEなどで加熱しSDS化したサンプル溶液は希釈することは可能でしょうか？その場合再加熱などの処理が必要になってくるのかどなたかわかる方ご教授ください。

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