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(無題) 削除/引用 No.3190-8 - 2014/07/04 (金) 16:08:41 - kh APさんアドバイス大変ありがとうございます。 うーんなるほど…鋳型が相補鎖を形成…なんでこんな単純なことが考えつかなかったのか、自分の考えの浅さに愕然とします。 …と、メーカーの情報を調べつつ返事を書いていたら追加でさらなるアドバイスをいただけたようで、本当に感謝しきりです。 正直、APさんがあっさりと看破されているまさにその通り、自分でも恥ずかしくなるぐらいの無知さ・不勉強さのため、いただいた極めて有用そうなアドバイスに対してすら理解が追いつかない状況なのですが…いずれにせよ割と差し迫って実験を進めなければいけない状況なので、叱責されてしかるべき姿勢とは思いますが、monさんの素晴らしすぎるアドバイスを大いに参考にさせていただいて、各デザインの意味をしっかり咀嚼した上で、真似るような形でプライマーを設計してみようと思います。 文献の読み込み不足を日々痛感している限りです。叱咤激励含めアドバイス本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3190-7 - 2014/07/04 (金) 15:01:53 - mon タンパク-RNAクロスリンクが良いか否かは不明ですが、 今風なら、5'-タグ配列A-dT18VN-3'で逆転写後、5'末端にタグ配列BオリゴDNAをRNA ligaseで連結、RNaseH処理、タグ配列Aオリゴとタグ配列BオリゴでPCRかな〜。 多分回収量は少ないから、タグ配列Bを長目のB+B'にしておいて、まずはA+B ー＞A+B '(nasted PCR)が良いかも。 あるいは、5'末端にTdTでオリゴdAを付けて、タグ配列B-dTとタグ配列Aオリゴでいけるかも。 （ある遺伝子をクローニングしたときは、dCテイルだとPCRが成功しなかった） タグ配列B-dTオリゴはRACE kitを参考にした、 5'-GAGTGAGTCTGAAGGGCGGATTTTTTTTTYTTTTTTTTV-3' はworkしています。 （途中Yを入れて有るのは、得られたクローンのシークエンスの時、ポリメラーゼが滑って波形が汚くなるのを防ぐため）

(無題) 削除/引用 No.3190-6 - 2014/07/04 (金) 14:58:37 - AP それとoligo mono nucleotide (e.g. (dT)n, (dG)n)のプライマーでPCRかけるとslippageで単一のいがた由来の産物でも長さがバラバラになってしまいます。3'末端一塩基、あるいは２塩基をdegenerateしておくのがいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3190-5 - 2014/07/04 (金) 14:23:24 - AP TdTでtailingしたり、アダプター化セットを末端にライゲーションしたり、poly A tailを利用したりして行うRT-PCRは古くから行われていて、いろいろな方法が考案され、いろいろな利点欠点も検討されてきています。そのへんの方法論について、成書、文献、メーカーの情報なんかを丹念に拾っていれば、あなたがゼロからそういうことに頭を悩ませなくてもいいと思うんですけれど。あなたが、書いておられるような方法論、疑問点なんかも、すでに論じつくされたことのように思いますが、いかが？　 結論をいうと、両端に同じプライマーというのは問題がありです。同一鋳型分子の両端に相補配列が存在することになり、それらが相補対を形成（アニール）してしまいプライマーからのプライミングを妨げます。この現象は逆に、両端に同一のアダプターをくっつけて鋳型内部の遺伝子特異的プライマーをアダプタープライマー間でPCRをかけるとき（adaptor ligation-mediated PCR)、両端のアダプタープライマー間でPCRがかかり、非特異的な副産物が生じるのが抑えられるメカニズムの一つとされています。

(無題) 削除/引用 No.3190-4 - 2014/07/04 (金) 13:29:17 - kh 特に質問の本質とは関係無いかと思いあえて詳細を書かなかったんですが、適切なアドバイスいただくためには省かない方がよかったですね。 あるターゲットタンパク質に、(natural conditionで) 結合している新規mRNAを見出したい →タグ付きタンパク質を発現している酵母をUVクロスリンクしタンパクとmRNAを共有結合させる →タグでIP →タンパク分解後、逆転写〜前述のステップ →サブクローニング後、シークエンスを読み、mRNAの配列を同定 といった感じです。 したがって、もちろん数をこなせることに越したことはないですが、特に定量的な解析をしたいわけではなく、サブクローニング後、シークエンスが読めれば十分という形になります（「定性的な解析」ということになるのでしょうか）。 ふと気付いたのですが、付加配列にdAを選んだ（＝オリゴdT 1種類のみでPCRを行う系）場合、PCR〜サブクローニング後、どちらの向きでインサートが挿入されたかが完全に不明になってしまうという致命的な欠陥がありますね。…しかしこれは、オリゴdTに異なる制限酵素サイトを付加したプライマーを用いれば解決可能な点ですかね。1種類のプライマーでPCRができるというアドバンテージはなくなりますが、大して大きなアドバンテージでもないため、現時点ではこの案がベストかな、という気がしています。 長くなりましたが、何かアドバイスいただける方がいらっしゃいましたらありがたく思います。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3190-3 - 2014/07/04 (金) 10:10:23 - ga Harmoniaの回答はいつもうざい。 質問に対する答えではなく、いつも的外れで面倒くさい説明を求める。 > これは何のための実験？ 特に、定量性とか定性性の観点からご説明をお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3190-2 - 2014/07/04 (金) 08:13:15 - Harmonia これは何のための実験？ 特に、定量性とか定性性の観点からご説明をお願いいたします。

両端に同じプライマー認識配列を持つ鋳型のPCR 削除/引用 No.3190-1 - 2014/07/04 (金) 05:49:43 - kh (1) 酵母由来のトータルmRNAをオリゴdTで逆転写 →(2) TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase)を用いて、得られたcDNAの3'末端に塩基を付加 →(3) 付加配列を認識するプライマーとオリゴdTとでPCR、という系を考えています。 ステップ(2)において、どのヌクレオチドを付加するか悩んでいるんですが… ・G or Cリピートは意図せぬ構造を作りそうなため避けたい ・Tを付加＝付加配列認識プライマーはオリゴdA；オリゴdAとオリゴdTがプライマーダイマーを形成しそうなので避けた方が無難…？ ・Aを付加＝付加配列認識プライマーはオリゴdT；オリゴdTのみで、得られたcDNAをPCR増幅することは可能…？ という点が疑問としてあるのですが、最後の例のような両5'端に同じ認識配列を持つ鋳型をPCRする場合、1種類のプライマーで問題なく産物は増えるものなのでしょうか。理論的には問題ない気がするのですが、何か見落としている落とし穴がありそうな気もしています。 また、最初に挙げたG/Cを避けたいという点はボスの意向なんですが、プロトコルによってはdCのポリマーを付加して5' RACEを行う、というものも見かけるので、そこまで気にするほどではないのかな、という気もします（しかし、あえてボスの意向に逆らうよりはT or Aでも問題がないのならそちらを優先したく思います）。 質問をまとめると、（タイトルと疑問点が少し異なりますが）「TdTで付加する塩基はどれがベストと思われるか？」というのがお尋ねしたい点の本質になります。 アドバイスいただけると大変幸いです。

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