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(無題) 削除/引用 No.3228-12 - 2014/07/30 (水) 01:51:32 - おお プライまーについてきたプロダクトシートはみましたか? ものによってはmassデーターまでついているとおもいますが。

(無題) 削除/引用 No.3228-11 - 2014/07/30 (水) 01:11:05 - ぺーぺー 配布元に依るのかもしれませんがプライマーの配列に誤りがあることはたまに有ります。ただし、3塩基連続で抜けるケースには出会ったことがないです。世間話ぐらいで聞いたことなんですが、会社でやっているオリゴDNA合成って相当に機械化されているんじゃないでしょうか。うっかり間違えるということはないかと……。ただ、以前クレームをいれた時、合成しなおしたオリゴと一緒にかなり定式化されたレポートが送られてきたので、ある程度の頻度で起こる事なんだろうとは思います。 何か行き違いがあったとかの可能性も高そうだと思うので、別の人からもらったものなどは、ひとつひとつ確認されるのが良いです。特に核酸サンプルについては「配列レベルで情報をもらう」ようにすれば、もしかしたら原因が判明するのかもしれないな、などと愚考します。

(無題) 削除/引用 No.3228-10 - 2014/07/29 (火) 16:45:43 - ｃDNA プライマーの末端ではない場合は合成会社のミスは普通は無いと思いますが、もちろん人間ですからね、間違いはあるかもしれません。（まず無いと思っていますけど） そこで、納品書に記載されている配列は注文した配列と同じでしょうか？システインは入っているかを確認した上で議論する必要があります。意外に注文時のコピペミスは侮れません。 プライマーをどうしても確認したい場合はPCR産物を問題にしているのとは反対側の鋳型でシークエンスするのが早いですよね。 それを前提に、会社に問い合わせて、「合成ミスの可能性はあるか？こちらで確認した場合、その費用を負担してくれるか？」と聞いたら、再合成して送ってくれる可能性が高いと思います。「合成ミスは絶対にない」と言われたらそれも面白いですね。 何度もやり直すとそのたびにシークエンスのコストがかかる訳だから、まずプライマーを確認するのはありだと思いますよ。プライマーが正しかったら、別のプラスミドに入れてから切り出して移す、とか何かしないと作れない特別な事情があるかもしれないですからね。（そんな状況が想像できないですが）

(無題) 削除/引用 No.3228-9 - 2014/07/29 (火) 16:31:38 - ~ >プライマー会社が間違えることはないのでしょうか？ たまにおかしい配列のプライマーが来たという話は聞きますね。 配列の問題か精製度の問題かは分かりませんが、増えないプライマーと 同じ配列を発注したら増えるようになったという話も聞きます。 ただ、プライマー会社はおそらくは発注時の電子データをそのまま使うか、 手入力で発注書の配列を入力しているでしょうから、途中の3merだけ 抜け落とすことは考えにくいですが。 発注時の記録やプライマーのデータシートの配列は確認しましたか？ その3merが入っていない配列のデータを持っているのはrikuemon さんだけでしょうから、 プライマー会社に間違えた配列を送った可能性を先に潰しておいた方がいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3228-8 - 2014/07/29 (火) 16:09:43 - rikuemon+ 返事が遅くなり申し訳ありません。 やはり，プライマーに配列が入っていないっていうことですか・・・ その旨を先生に提言しても， 「プライマーの発注会社が間違えるわけない。」と言われます。 プライマー会社が間違えることはないのでしょうか？ 人間ですので，間違えることはあると思っているのですが・・・ プライマーが間違っていたという経験をしたことがある方はいらっしゃいますか？ 質問ばかりですいません。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3228-7 - 2014/07/22 (火) 19:08:19 - 774R いや、シーケンスした配列が鋳型と異なるのであれば、鋳型混入の可能性は排除して構わないです。 また、プライマー領域はPCR反応で何が起ころうとも変化する訳はないので、シーケンスした結果はプライマー配列を反映してるはずです。 したがって、使用したプライマーが思っていたものと違う配列である可能性しか考えられません。

皆さん，お早い対応ありがとうございます。 削除/引用 No.3228-6 - 2014/07/22 (火) 18:45:13 - rikuemon 皆さん，ご回答ありがとうございます。 5`-Xho�T-kex2-protein-3`の配列はpUC19の方にはなく， pUC19の方には5`-EcoR�T-Xho�T-protein-3`が挿入されています。 なので，鋳型は考えにくいのかなと思ったのですが・・・ 説明不足で申し訳ありません。 ただ，自分の勉強不足で鋳型という可能性はあまりないのかなと 勝手に思い込んでいた節がありました。 しかし，鋳型以外に考えられることがなく 皆さんに提案していただいた案をもとに 一度実験をおこなってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3228-5 - 2014/07/22 (火) 16:59:51 - mut もとのプラスミドがpUC19で、TAクローニングに使ったプラスミドが異なるなら、すでに解析したプラスミドのシークエンスを見直せば、PCRの鋳型につかったpUC19の混入かどうかはわかりますけど、どうでしょうかね。 1アミノ酸挿入のポイントミューテーションのやり方はいろいろあってキットにもなっていると思うのですが、そういう方法を参考にするのも代替としてよいと思いますよ。 ちなみに、簡単なのでQuikChangeのプロトコールを参考にやって、問題なく変異体を作ってました。

(無題) 削除/引用 No.3228-4 - 2014/07/22 (火) 11:02:47 - mon 皆さんが指摘しているように、鋳型DNAの混入かなと思います。 TAクローニングする前のPCR産物だけを導入してコロニーがどれだけ出来るか比較すると良いと思います。変性した鋳型plasmidでも鋳型plasmidと同等数のコロニーは出現しますよ（コンピテントセルの効率を考えてください）。 鋳型を減らすには、「DpnI処理」か「電気泳動でPCR産物のバンドを切り出す」、あるいはその両方が有効です。DpnI（制限酵素）はPCR反応後に直接添加し37℃で30分ほど保温すれば良いです（その後精製か熱失活させて、TAクローニングへ）。 少し工夫するなら、primerに新たな制限酵素部位を仕込んでおいて、変異体が鋳型plasmidと区別出来るようにする事もシークエンスの手間を減らす手法です。ただしマイナーコドン等だと発現量が低下する場合もあります。 TAクローニングするベクターの薬剤耐性が鋳型Plasmidと異なるものを使用するのも手間がかからない方法です。

(無題) 削除/引用 No.3228-3 - 2014/07/22 (火) 07:16:59 - おお 5`-Xho�T-kex2-protein-3`の配列はpUCにはいったテンプレートにはあるんでしょうか? よくわからないことが起こったら違う方法論でやってみるというのもてです。原因が分からないままあれこれやるとかえって長引くこともあるので。もちろん明らかな間違えや勘違い、方法としてよくないところなどは見つけて解決した方がいいですけど。

(無題) 削除/引用 No.3228-2 - 2014/07/22 (火) 02:07:16 - ぺーぺー ・プライマーの設計ミス ・PCR鋳型のプラスミドの混入 ・誤ったシークエンス鋳型 以上の何れかである可能性が高いと思います。

プライマーを用いたシステイン残基導入について 削除/引用 No.3228-1 - 2014/07/22 (火) 01:27:59 - rikuemon 初めての質問ですので説明のコツなど分からず長文になりますが お手柔らかにお願いします。 私は応用生命専攻の大学院に所属しています。 あまり遺伝子操作を行っていない研究室なのですが・・・ 私の研究内容の一部といたしまして， あるたんぱく質（98アミノ酸）にシステイン残基を導入する実験を行っています。 導入するシステイン残基はタンパク質のN末側に， プライマーを用いてPCR法で挿入を行っています。 そのタンパク質の塩基配列はプラスミドベクターであるpUC19のMCSに保存されており， N末側にシステイン残基付加のプライマーを用いて PCR法でpUC19から切り出した産物を，TA-vectorクローニングで導入後, シーケンス解析に依頼しています。 プライマーの配列は 5`-Xho�T-Kex2-cys-protein-3` 5`-Xba�T-stop コドン-protein-3`です。 しかし何回やっても，システイン残基だけが挿入されず， 毎回，N末側が 5`-Xho�T-kex2-protein-3` というようにcys残基が抜けてしまっています。 ここで質問があるのですが， 何回やってもだめということで なぜシステイン残基が挿入できないのか ということをお聞きしたいです。 私の力量不足というのもあると思いますが システイン残基だけが入っていない理由が 皆目見当もつかず途方に暮れています。 プライマーの作製を依頼した会社のミスというのも あるのかなあと考える次第です。 どうか，ご教授いただけますようよろしくお願い致します。

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