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(無題) 削除/引用 No.3231-12 - 2014/07/24 (木) 16:45:48 - ごん 18sもリッチですが、競合プライマーを使うことで 飽和を防ぐことができるので、目的のバンドがしっかり見えるまで サイクルを増やすときは便利ですよ。 昔Ambionから出てるのを使ったことがあります。

(無題) 削除/引用 No.3231-11 - 2014/07/24 (木) 13:02:08 - ヴェスパ >おお　様 >GAPDH　様 いろいろとご指摘いただきありがとうございました とりあえずGAPDHのサイクル数を下げてもう一度比較をしてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3231-10 - 2014/07/24 (木) 02:11:39 - おお 1ugのtotal RNAでこの手のinternal controlは18サイクルも回せば検出できるような気がしますね。。。飽和しているので差が見えない可能性は確かに考えた方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3231-9 - 2014/07/24 (木) 01:28:33 - GAPDH GAPDHで29サイクルは多いと思うなあ。細胞によるのでしょうけど、29なら飽和の可能性あると思います。cDNAを希釈してPCRをかけていたりしますか? 試しに、27、29、31とかで回して見てください(私だったら、同じサンプルを3チューブ作ってマシンを31サイクルに設定して動かして、28の95C、30の95CでマシンをPAUSEしてチューブを取り出します)。それで、大ざっぱにバンドの濃さが4倍づつ変わっていればよいのですが、3本とも似たような濃さになる(あるいは、27が若干他2本より薄い程度)可能性、結構高いと思いますよ。 私だったら、29サイクル回したGAPDHでの比較はしないです。実態を反映しないと思うから。

(無題) 削除/引用 No.3231-8 - 2014/07/24 (木) 00:40:00 - ヴェスパ ＞GAPDH 様 宛先を間違えておりました申し訳ございません

(無題) 削除/引用 No.3231-7 - 2014/07/24 (木) 00:38:48 - ヴェスパ >おお　様 有難うございます 飽和のことを失念しておりました。 一応29サイクルで行っております。 前の人のプロトコールでも29サイクルでおりました。 ということは、実際には濃度にかなりの差があるが29サイクルでいずれも飽和しており、バンドの濃度に差が見られない。 GAPDH以外に関しては、発現量が低くかつ前の人のサンプルとの濃度の差を埋めるだけのサイクル数には足りていない。 と考えた方がよろしいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3231-6 - 2014/07/24 (木) 00:30:33 - GAPDH 念のため。GAPDHのPCRは何サイクル回していますか? なにせ豊富にあるので、ものによっては25サイクル回したら飽和してしまって、実際には存在する差が見かけ上みられなくなることがありますよ。

(無題) 削除/引用 No.3231-5 - 2014/07/24 (木) 00:17:46 - ヴェｓパ >おお　様 ありがとうございます リアルタイムＰＣＲをしないと実際のＧＡＰＤＨの差というのは分かりませんが、同じサンプルと考えていいと思います。 ・cDNAの作成に使用したkitの違いが影響を与えているならばGAPDHにも何らかの違いが出てくるはず。 ・前の人のサンプルをコントロールとして半定量PCRを行ってもGAPDH以外のバンドの濃さがはっきり違う。 この2点が引っ掛かっております

(無題) 削除/引用 No.3231-4 - 2014/07/24 (木) 00:00:26 - おお では両者のサンプルは同じと考えていいものでしょうか?同じと考えていいものであれば、なにかおかしい可能性があるのでは?

(無題) 削除/引用 No.3231-3 - 2014/07/23 (水) 16:55:38 - ヴェスパ >おお　様 ありがとうございます GAPDHですが前の人と同じ程度のバンドが検出されましたので、cDNAの濃度が前の人のサンプルより極端に低い、といったようなことはなさそうです。

(無題) 削除/引用 No.3231-2 - 2014/07/23 (水) 12:46:53 - おお お使いになっているキットなどよくわからないところがまあまああるのですが、GAPDHはその前の人が作った cDNAと比べてどうでしょうか?

半定量ＲＴ−ＰＣＲについて 削除/引用 No.3231-1 - 2014/07/23 (水) 10:24:09 - ヴェスパ 初めて投稿させていただきます 現在、TaqmanのFast cell to Ct kitを使ってMSCからcDNAを作成しております。 cDNAを使用してＰＣＲを行い電気泳動しましたが、目的とするバンドが薄くしか検出されません。 これまでの結果として �@使用したＭＳＣの数は十分ある(kitの上限ぎりぎり、10の5乗個) �A内在性のコントロール遺伝子(GAPDH)はしっかりとしたバンドがでる �B以前に別の方が作成したcDNA(おそらく別のkit)からは、同じＰＣＲ条件で目的のバンドが濃く検出される といった結果が得られております。 cDNA作成時の手技の問題なのか、目的とする遺伝子の発現量が低く、kit上限の細胞数ではまだまだ少ないのか、PCR条件の問題なのか悩んでおります。 ご指導よろしくお願いいたします

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