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(無題) 削除/引用 No.3242-19 - 2014/07/31 (木) 16:32:21 - むずい >>APさん おおさん ありがとうございます。 理解できました。 >>独り言 さん こんがらがっているのは、話では無く、私の思考回路でした。

(無題) 削除/引用 No.3242-18 - 2014/07/30 (水) 00:14:53 - AP PCR の手引き本や、Molecular Cloningなどには普通に記載されているはず。

(無題) 削除/引用 No.3242-17 - 2014/07/30 (水) 00:12:21 - AP >すいません。まだ、当方のゲノムの定義が一致していません。植物体ゲノムとは、１細胞内の核ゲノム＋葉緑体ゲノムということでしょうか？ また、濃度既知のコントロールDNAとは、本植物の核ゲノム内のハウスキーピング遺伝子のコピー数が既知のサンプルということでしょうか？ 表現がふてきせつだったかもしれませんが植物体ゲノムは、核ゲノムのつもりでした。 コントロールDNAとは、書いておりますように、クローン化したDNAまたはPCRで得たDNAフラグメントです。理解していただくには、competitive PCRの原理を勉強していただく必要があるようです。

(無題) 削除/引用 No.3242-16 - 2014/07/30 (水) 00:07:04 - 独り言 話がこんがらがっていて、よくわからないのですが、 葉緑体にコピー数が存知の遺伝子があれば、その遺伝子の定量PCRの増幅効率と、目的遺伝子の増幅効率を比較すればいいだけのはずが、それができない？？？ 少なくとも私は、２倍対の培養細胞のゲノムを用いて、２コピーか、１コピー（ヘテロ）かKOかどうかを相対定量PCRで調べた事あります。

(無題) 削除/引用 No.3242-15 - 2014/07/30 (水) 00:02:19 - おお >[Re:13] むずいさんは書きました : > ＞＞monさん > > すいません。まだ、当方のゲノムの定義が一致していません。植物体ゲノムとは、１細胞内の核ゲノム＋葉緑体ゲノムということでしょうか？ > また、濃度既知のコントロールDNAとは、本植物の核ゲノム内のハウスキーピング遺伝子のコピー数が既知のサンプルということでしょうか？ http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-313X.2010.04389.x/pdf Please read DNA isolation and quantitative real-time PCR in Materials and methods They calculate dCts between Cts of mitochondria DNA and nuclear DNA qPCR. You could also use some standards for quantification. We have already discussed how to get the standards. www.mtdna.or.kr/neowiz/board/up_files/files_14/Tissue-specific_differencesinmitochondrialDNAcontent.pdf > 限外濾過やゲル切りで、増幅産物を回収したものを使用してコピー数を求めることは、ロジックとしては正論だと思いますが、実際の回収率のバラつきを考えると、論文等でディスカッションできる程の現実性に欠けるように思います。当方で、同様のことを行っている論文を検索しましたが、認められませんでした。以上のことから、本法は、現実的では無いのでしょうか？ ついでにPCR cleaning kitなるものもうってます。dNTPやプライマーがどの程度のこるかはそれぞれのきっとでちがうかもしれません。products sheetなどみてください。

(無題) 削除/引用 No.3242-14 - 2014/07/29 (火) 22:46:46 - おお >[Re:13] むずいさんは書きました : > ＞＞おお　さん > > >精製はゲルから切り出しするのが一般的です．．．．．．．．．． > > 限外濾過やゲル切りで、増幅産物を回収したものを使用してコピー数を求めることは、ロジックとしては正論だと思いますが、実際の回収率のバラつきを考えると、論文等でディスカッションできる程の現実性に欠けるように思います。当方で、同様のことを行っている論文を検索しましたが、認められませんでした。以上のことから、本法は、現実的では無いのでしょうか？ なんで? 精製後のDNAの濃度がわかれば、スタンダードとして使えるでしょ。スタンダードの話ですよ。

(無題) 削除/引用 No.3242-13 - 2014/07/29 (火) 20:21:26 - むずい ＞＞monさん >相当なお金持ちなら、デジタルPCRかな？ 相当お金がありません（笑）。ですが、デジタルPCRは、技術的にベストかも知れませんね。 ＞＞APさん >調製したDNA溶液の中に標的遺伝子が実際に何コピーあるかを知りたいだけだということですね。サンプル間で抽出効率の違いや希釈率の違いがあったとしても問題ではなく、内部標準的なもので補正して、ある単位あたりのコピー数で標準化するとか、そういうことは考えなくていいと。 おっしゃる通りです。 >おおさんの言っているのは、先に挙げた(2)のように、植物体ゲノムのコピー数を内部標準として、葉緑体ゲノムのコピー数を標準化する（植物体ゲノム1あたり葉緑体ゲノムが何コピー含まれているか）ということのようです。ゲノムとは何のゲノムを指しているのか云々、の疑問はそこんところの行き違いでしょう。おおさんのおっしゃるとおり、そういう事をするなら濃度既知のコントロールDNAを標準として使用します。PCRで増幅される配列を含むクローン化DNA、またはPCR産物そのものを使います。 すいません。まだ、当方のゲノムの定義が一致していません。植物体ゲノムとは、１細胞内の核ゲノム＋葉緑体ゲノムということでしょうか？ また、濃度既知のコントロールDNAとは、本植物の核ゲノム内のハウスキーピング遺伝子のコピー数が既知のサンプルということでしょうか？ ＞＞おお　さん >精製はゲルから切り出しするのが一般的です．．．．．．．．．． 限外濾過やゲル切りで、増幅産物を回収したものを使用してコピー数を求めることは、ロジックとしては正論だと思いますが、実際の回収率のバラつきを考えると、論文等でディスカッションできる程の現実性に欠けるように思います。当方で、同様のことを行っている論文を検索しましたが、認められませんでした。以上のことから、本法は、現実的では無いのでしょうか？ ＞＞かしの木　さん コメントありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3242-12 - 2014/07/28 (月) 09:24:52 - mon 相当なお金持ちなら、デジタルPCRかな？

無理では？ 削除/引用 No.3242-11 - 2014/07/28 (月) 02:25:37 - かしの木 むずいさんの希望するようなデータを出すのは無理でしょう。 細胞ごとの葉緑体(本件はプラスチドと呼ぶ方が妥当)の数が 種、組織、細胞のage、栽培条件などによって大きく異なるからです。 また、Realtime-PCRでは数倍程度の差を正確に定量するのはなかなか難しいです。 ある程度分化した植物組織では核も倍数化しますので、 補正するための正確なスタンダードもとれないのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3242-10 - 2014/07/27 (日) 16:54:12 - AP >そのため、任意のサンプルから抽出したDNA内にrbcL遺伝子が何コピー存在するのかを、 つまり、調製したDNA溶液の中に標的遺伝子が実際に何コピーあるかを知りたいだけだということですね。サンプル間で抽出効率の違いや希釈率の違いがあったとしても問題ではなく、内部標準的なもので補正して、ある単位あたりのコピー数で標準化するとか、そういうことは考えなくていいと。おおさんの言っているのは、先に挙げた(2)のように、植物体ゲノムのコピー数を内部標準として、葉緑体ゲノムのコピー数を標準化する（植物体ゲノム1あたり葉緑体ゲノムが何コピー含まれているか）ということのようです。ゲノムとは何のゲノムを指しているのか云々、の疑問はそこんところの行き違いでしょう。 おおさんのおっしゃるとおり、そういう事をするなら濃度既知のコントロールDNAを標準として使用します。PCRで増幅される配列を含むクローン化DNA、またはPCR産物そのものを使います。 理想的なのは、コントロールDNAの濃度を振ってサンプルに混ぜて、PCRをかけてサンプル由来のPCR産物と等量のPCR産物を生じるコントロールDNAの濃度を求めるという方法です（competitive PCR)。 インターカレーターを使用する、あるいは一色で検出するリアルタイムPCRでは無理ですが、標的DNAと区別するために内部にマイナーな改変をしたコントロールDNA(competitor DNA）を加えて、二色使ってそれぞれをTaqMan法で検出するということは出来ます。 あるいは、増幅効率を大きく変えない程度の塩基長の改変、あるいは内部に制限酵素サイトの導入または欠損を加えたコントロールDNAを用意すれば、PCR産物をそのままあるいは制限酵素消化してゲル塩基泳動し、標的由来のPCR産物とコントロールDNA由来のそれが等しくなるポイントが求められます。

(無題) 削除/引用 No.3242-9 - 2014/07/27 (日) 10:58:03 - おお >[Re:8] むずいさんは書きました : > >おお さん > 具体的な手順としては > �@前述のプライマーセット(増幅長100bp)を用いてPCRを行う。 > �AプライマーとdNTPを除去するために限界濾過等を行う。 > �B分光光度計でDNA量を測定する。 > �C測定量（ug) ／ 100bpの重量 = コピー数 > > ということでしょうか？ そうですね。精製はゲルから切り出しするのが一般的ですけど。ノンすぺがないならdNTPとプライまーが除ければまずだいじょうぶでしょう。 > 前述のとおり、おお さんがおっしゃるゲノムが、何のゲノムか分かりません。 > コピー数を知りたい遺伝子は、1葉緑体ゲノムあたり1コピーです。 > しかし、1細胞あたりの葉緑体の数が不明のため、1細胞あたりの葉緑体ゲノムのコピー数は分かりません。 細胞核にある遺伝子のqPCRの結果がctが27で葉緑体の遺伝子のCt値が20なら核の遺伝子のコピー数の2^7倍のコピー数があるという計算になりませんか?ただしプライまーの増幅効率が100%といっていいぐらいのものが設計されている必要があります。 増幅効率を求めて計算していけるかもしれませんが、その時どれくらい正確なのかは経験がないのでわかりません。

(無題) 削除/引用 No.3242-8 - 2014/07/27 (日) 09:48:11 - むずい >おお さん ありがとうございます。 >たとえば、そのプライまーで増幅したDNAフラグメントを抽出してきて、DNA量を定量すれば通常はug/ulとかで算出するでしょうけど、それをモルベースで換算できるわけですし。1モルの分子数は高校で習ったはず。 PCRフラグメント出なくってその部分が組み込まれたプラスミドでも同様に計算できますよね。 具体的な手順としては �@前述のプライマーセット(増幅長100bp)を用いてPCRを行う。 �AプライマーとdNTPを除去するために限界濾過等を行う。 �B分光光度計でDNA量を測定する。 �C測定量（ug) ／ 100bpの重量 = コピー数 ということでしょうか？ >ゲノムの遺伝子は細胞あたりなんコピーかわかりますよね(何倍体かを考慮に入れれば)。それを基準にすれば、葉緑体の遺伝子がゲノムの遺伝子の何倍細胞に存在するか計算できませんか? 前述のとおり、おお さんがおっしゃるゲノムが、何のゲノムか分かりません。 コピー数を知りたい遺伝子は、1葉緑体ゲノムあたり1コピーです。 しかし、1細胞あたりの葉緑体の数が不明のため、1細胞あたりの葉緑体ゲノムのコピー数は分かりません。

(無題) 削除/引用 No.3242-7 - 2014/07/27 (日) 05:14:34 - おお >[Re:6] むずいさんは書きました : > >おお さん > > ありがとうございます。 > > >コピー数のわかったスタンダードがあればいいだけの話じゃないの? > > おっしゃるとおりですが、ある特定の植物の葉緑体ゲノムまたは遺伝子のコピー数が分かった標準品が無いため検討しているのですが、そのようなものを購入することが可能なのでしょうか。 たとえば、そのプライまーで増幅したDNAフラグメントを抽出してきて、DNA量を定量すれば通常はug/ulとかで算出するでしょうけど、それをモルベースで換算できるわけですし。1モルの分子数は高校で習ったはず。 PCRフラグメント出なくってその部分が組み込まれたプラスミドでも同様に計算できますよね。 > > >あるいはゲノムを基準にするならば、プライまーの増幅効率が理想的であればCt値の比較でわかるはず。 > > ゲノムとは核、葉緑体、または両方のでしょうか？ > また、ct値の比較とは、何を一定量のコピー数として考えるのでしょうか。 ゲノムの遺伝子は細胞あたりなんコピーかわかりますよね(何倍体かを考慮に入れれば)。それを基準にすれば、葉緑体の遺伝子がゲノムの遺伝子の何倍細胞に存在するか計算できませんか?

(無題) 削除/引用 No.3242-6 - 2014/07/27 (日) 05:02:11 - むずい >おお さん ありがとうございます。 >コピー数のわかったスタンダードがあればいいだけの話じゃないの? おっしゃるとおりですが、ある特定の植物の葉緑体ゲノムまたは遺伝子のコピー数が分かった標準品が無いため検討しているのですが、そのようなものを購入することが可能なのでしょうか。 >あるいはゲノムを基準にするならば、プライまーの増幅効率が理想的であればCt値の比較でわかるはず。 ゲノムとは核、葉緑体、または両方のでしょうか？ また、ct値の比較とは、何を一定量のコピー数として考えるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3242-5 - 2014/07/27 (日) 00:21:44 - おお あるいはゲノムを基準にするならば、プライまーの増幅効率が理想的であればCt値の比較でわかるはず。

(無題) 削除/引用 No.3242-4 - 2014/07/27 (日) 00:12:05 - おお コピー数のわかったスタンダードがあればいいだけの話じゃないの?

(無題) 削除/引用 No.3242-3 - 2014/07/26 (土) 19:50:14 - むずい >APさん ありがとうございます。 質問に対する回答は、3)それ以外 です。 本植物から抽出したDNAを用いて、本植物の種間の判別をTaqMan プローブによるrbcL遺伝子のSNPタイピングを行います。 その際に、検出限界の最低コピー数を検討したいと思っています。 そのため、任意のサンプルから抽出したDNA内にrbcL遺伝子が何コピー存在するのかを、インターカレーターによる定量rPCRで求めたいと考えています。 明瞭な説明が出来ているか不安ですが、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3242-2 - 2014/07/26 (土) 18:52:01 - AP >同遺伝子のコピー数を求める方法が分かりません。 コピー数と言われても、なにを求めたいのか文意が取れないのですが、 １）当該遺伝子はゲノム中に多コピーあり、葉緑体ゲノムあたりのコピー数を求めようとしている。 ２）当該遺伝子は葉緑体ゲノムあたりシングルコピーのユニーク遺伝子である。宿主ゲノムあたり、葉緑体当該遺伝子が何コピー存在するか（これは細胞一個あたり、葉緑体ゲノムが平均何コピー存在するかということと同義になると思うが）を知りたい。 3)それ以外 どれでしょう。

葉緑体ゲノム上の遺伝子のコピー数の調べ方 削除/引用 No.3242-1 - 2014/07/26 (土) 16:05:20 - むずい ある植物について、rbcL遺伝子領域内の約100bpを増幅させるプライマーセットを作製し、インターカレーターによる定量リアルタイムPCRの反応系を作りました。 濃度の標準サンプルは、同植物をplant kit(キアゲン)で抽出した、核と葉緑体ゲノムの混合DNAを段階的に希釈したものを用いました。 以上で、暫定的な定量は可能になったのですが、同遺伝子のコピー数を求める方法が分かりません。 現在、得られている情報は、�@同植物の葉緑体ゲノムの全長、�A一般的に葉緑体のコピー数/細胞は、数千コピーであり、組織によって異なること、�B同植物の葉緑体のコピー数の報告が認められないこと です。 何かしらのアプローチで、コピー数が調べられるでしょうか。

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