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(無題) 削除/引用 No.3298-9 - 2014/08/20 (水) 02:41:17 - あ わかりました。継代し続けた細胞でまずアッセイしてみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3298-8 - 2014/08/19 (火) 17:34:52 - MP Lさんのコメントに加えて、p53のshRNAによるノックダウン（レンチウイルスが売られている）、Bmi1 発現によるArfの発現抑制なんかもありだと思います。 培養継続がいちばん楽ですけどね。

(無題) 削除/引用 No.3298-7 - 2014/08/19 (火) 16:10:28 - L MEFの場合、senescenceに入った後も培養を継続するだけで、p53変異やp19ARF欠失が生じて不死化しますので、少なくともwild-typeのMEFの不死化には遺伝子操作の必要はありません。NIH3T3細胞はそのようにして樹立された細胞株で、p19ARFが欠失しています。 ただし、お使いのKO-MEFで同様に自然に不死化するかどうかはやってみないと分かりません。もし不死化しないようなら、そのKO-MEFの表現型の一つという事になります。 遺伝子操作で最初から不死化したラインをどうしても樹立したい場合は、SV40 large T抗原を遺伝子導入すれば、p53/pRbが不活化されて不死化します。SV40 large Tの発現ベクターは市販されていると思います。

(無題) 削除/引用 No.3298-6 - 2014/08/19 (火) 15:09:16 - あ 市販のimmortalize用のプラスミドやコンストラクトで良いのありますか？ 出来れば市販が良いのですが、以前探したも見つからなくて、もしご存知でしたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.3298-5 - 2014/08/19 (火) 08:00:39 - MP とりあえず、immortalizeしたMEFも作ってみるのはダメですか？ その信号経路がセネッセンスとかに関与しているとかであれば、ちょっと無理ですが。

(無題) 削除/引用 No.3298-4 - 2014/08/19 (火) 02:15:56 - あ 細胞内信号伝達遺伝子のKO-MEFに、変異を入れたcDNAをトランスフェクションして信号経路の活性化を解析をしています。5 passageだと２週間ほどでしょうか。Senescenceの細胞が混じっても調べている信号経路が生きていれば今のところは構わないのですが、基本は頻繁に入れ替えて、継代数を増やしても変質しないか確認してみます。

(無題) 削除/引用 No.3298-3 - 2014/08/17 (日) 05:51:55 - L どのような実験を行っているのでしょうか？　それによって継代の仕方も変わってくると思います。 一般的な3T3培養の場合、10 passageを越えたあたりで増殖はほぼ止まります。5 passage前後でも、初代培養と比べると明らかに増殖速度が遅く、senescenceに入った細胞がある程度混在しています。Senescenceの細胞が混じると問題になる実験を行っているのであれば、可能な限りearly passageのMEFを使った方が良いので、頻繁に入れ替える今の方法で良いのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3298-2 - 2014/08/16 (土) 09:54:12 - ~ 一般的にはMEFは継代数で管理しません。 十分に実験系が作り込まれていれば、その系の中での目安となる継代数を設定できますが、 書かれている内容からでは、そこまで実験系を作り込んでいないように読み取れます。 MEFの取り方を知ることができたのですから、同様の方法で、MEFがどのように研究に用いられているかも知ることができるでしょう。 老化の目安は増殖速度や細胞の形態を見る方法が非破壊検査で使いやすいです。 老化特異的βガラクトシダーゼ活性を評価する方法もありますが、 活性が見れる頃には増殖速度や形態が変化してますので、 後付のデータになってしまいます。

MEF継代数 削除/引用 No.3298-1 - 2014/08/16 (土) 09:06:58 - あ MEFの継代数は何回くらいで入れ替えて実験するのが一般的ですか？ 一度作ればたくさんとれますから、頻繁に入れ替えているのですが、senescentと 継代数の目安があったら教えてもらえませんか？

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