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(無題) 削除/引用 No.331-13 - 2012/04/03 (火) 13:31:15 - 投稿者 >月詠さん >１５ｍＬのコニカルチューブに１０〜１２ｍＬづつ（クリーンベンチ内で無菌的に）分注後−２０℃で保存 >２〜３日中に使いきりそうな場合は４℃冷蔵 >可能な限り無菌的に扱うようにして、アジ化ナトリウムは使用しないようにしています ありがとうございます。 参考にさせて頂きます。 >リア充さん 毎日westernしてると、バッファー作る1-2分が惜しくなりますよ。 ストックを用意しておくと、時間的・気持ち的にすっきり効率良くなります。 解凍時間に関しては、 1.実験前に予め室温 2.解凍体積を小さくする（50でなく15mlチューブに保存*） で、やぼったさは感じない。 *チューブ・保管スペースの節約としては、 50mlチューブに大ストックとして何本か作って、 15mlチューブの小ストックがなくなったら、50から15mlに分注 で解決するのかな？細かいけど。

(無題) 削除/引用 No.331-11 - 2012/03/31 (土) 19:52:45 - リア充 ブロッキングバッファーは使う日に、おおよその必要量調製、余ったら捨てだな。ていうか手間的、中身的、コスト的にみて保存するほどのものではないと思うんだが。

(無題) 削除/引用 No.331-10 - 2012/03/25 (日) 04:39:25 - 月詠 わたしの場合は１５ｍＬのコニカルチューブに１０〜１２ｍＬづつ（クリーンベンチ内で無菌的に）分注後−２０℃で保存し、使用時に融解しています。 使い残りは、２〜３日中に使いきりそうな場合は４℃冷蔵、しばらく使わない場合は−２０℃で再凍結保存しています。可能な限り無菌的に扱うようにして、アジ化ナトリウムは使用しないようにしています（劇毒物の登録や残量管理が面倒ですので…＾＾；）。 ブロッキングが目的ですので、凍結再融解を繰り返して多少ブロッキング剤中のタンパク質（主にＢＳＡ）が変性してしまっていてもあまり問題はないだろうと勝手に思っています（でもデータ的な根拠はありません）。もちろん再融解後に、タンパク成分が凝集しているような場合には使用しない方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.331-9 - 2012/03/23 (金) 20:41:44 - 投稿者 >APさん >peroxidaseが不可逆的に失活します。 >一般論ではなく、peroxidase標識に限って注意すべきことです。 そうだったんですか。 >融かすのにあまり時間がかからない分量で分注して凍結保存しています（50-mLコニカルチューブなどで） そうですね。 私も大本のストックは50 mL falconに分注して 凍結保存しています。 >融かしたものには、特に理由がなければNaN3の添加を躊躇しません。 そうしてみようと思います。 >kodamataroさん >アザイド >簡易リプローブ試薬としての応用もできます。 勉強になります。

(無題) 削除/引用 No.331-7 - 2012/03/23 (金) 16:51:23 - AP >冷凍保存で数ヶ月もつと言われていますが、 >冷蔵4℃だとどれほどもつのでしょうか？ 調製時の滅菌状態やその後の取り扱い方法によるでしょう。 十分な滅菌を施し（器具の滅菌、可能な試薬であればオートクレーブ、フィルター滅菌など）密栓していれば冷蔵や室温でも長期保存できるでしょうし（血清入り培地や細菌培地だってそうでしょう？）、フタの開閉をクリーンベンチの中ででもやって、汚染を避ければ腐らせずに使い切れることでしょう。 そんなことはやってられないので、私は、短期間で使いきれ、かつ融かすのにあまり時間がかからない分量で分注して凍結保存しています（50-mLコニカルチューブなどで）。融かしたものには、特に理由がなければNaN3の添加を躊躇しません。使い残りは連続して使用するときには冷蔵しますが、しばらく使わないなら再冷凍して保存します。

(無題) 削除/引用 No.331-6 - 2012/03/23 (金) 16:38:13 - kodamataro >一次抗体にアザイドを入れての使いまわしは一般的なのですね（少なくともスレッド上では）。 １次抗体にアザイドを入れて使いまわすことは私もやっています。 たとえばCST社の抗体は100μlしか入っていませんが 10CCで抗体を作って終濃度アザイド0.02%のアザイドを加えておけば （10CCを５回使いまわすとして）そこそこの量のメンブレンを検出できます。 ＞アザイドは２次抗体の標識を失活させてしまう 逆にこれを利用して、少し濃度が高いアザイドinTBSTを染色後のメンブレンに作用させてHRPを失活させる、つまり簡易リプローブ試薬としての応用もできます。(その後の洗いは念入りに行います）

(無題) 削除/引用 No.331-5 - 2012/03/23 (金) 16:37:42 - AP >＞アザイドは２次抗体の標識を失活させてしまう >重要ですね。 peroxidaseが不可逆的に失活します。その他の酵素、例えばAlkaline phosphataseの標識などには影響ありません。もちろん蛍光標識も。なので、一般論ではなく、peroxidase標識に限って注意すべきことです。

(無題) 削除/引用 No.331-4 - 2012/03/23 (金) 15:52:16 - 投稿者 ＞kodamataroさん ＞アザイドを加えてみてはいかがでしょうか。 関連スレッドを見つけました。 http://kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=140 一次抗体にアザイドを入れての使いまわしは一般的なのですね（少なくともスレッド上では）。 2年前にアザイド添加4℃保存した抗体でも、問題なく使えたケースもあるようですね。 ＞アザイドは２次抗体の標識を失活させてしまう 重要ですね。 ＞Qさん ＞モヤモヤがあれば廃棄みたいな。 パワープレーですね。 最終的にバンドが出れば問題ないと。 ブロッキングバッファーは用事調整の必要はなく、 長期保存であればアザイドを添加、 数日以内であればアザイドなしでも使用に耐える、 という理解でいいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.331-3 - 2012/03/23 (金) 13:14:15 - Q >冷蔵4℃だとどれほどもつのでしょうか？ うちでは、毎回使う前に見てみて、明らかにバクテリアがいるようなモヤモヤが無ければ使い続けています。モヤモヤがあれば廃棄みたいな。どれくらいもつかというより、どれくらいもったかだと思います。

(無題) 削除/引用 No.331-2 - 2012/03/23 (金) 12:51:29 - kodamataro 冷蔵庫に入れた食材が腐敗するのと同じ理屈で、短期間に使い切るのが原則だと思います。 長期間持たせたい場合は終濃度0.02%アザイドを加えてみてはいかがでしょうか。 ただし、アザイドは２次抗体の標識を失活させてしまうため、２次抗体を希釈する液には使用できません。

western, ブロッキングバッファーの保存方法？ 削除/引用 No.331-1 - 2012/03/23 (金) 12:27:30 - mbp15 ものすごく基本的なことで恐縮なのですが、 ブロッキングバッファーは 冷凍保存で数ヶ月もつと言われていますが、 冷蔵4℃だとどれほどもつのでしょうか？ 組成にもよるかもしれませんが。 当方はBSAをブロッキングに用いています。 50 mM TrisHCl pH 7.4 150 mM NaCl 0.1 % Tween20 2 % BSA

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