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みみ先生 削除/引用 No.3314-11 - 2014/08/28 (木) 09:50:10 - みこ おはようございます。お礼が遅れてすみませんでした。 ゲルのことだけでなくウェスタンのポイントまで教えてくださってありがとうございます。 おかげさまで諸先生方が仰るようにメンブレンの上で置きなおしたゲルでもきれいに転写され、発光検出できました。 バンドも目的のものがしっかり検出できました。 本当にありがとうございました。 これからは失敗を恐れず、でも慎重にビクビクしないで実験していけるように日々努力いたします。 コメントしてくださった先生方、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3314-10 - 2014/08/27 (水) 14:51:44 - みみ ゲルを扱う際のポイント ・当然手袋する。 ・ゲルを持つとき、転写バッファーで手を濡らす。 ・つまんだゲルが弛むように左右の手の距離を意識する。 上記のことを守ればゲルは破れないし失敗しない。 あと別件かもしれないが、ウエスタンのポイント ・メンブランやゲルを重ねていくとき転写バッファーを毎回かける ・メンブラン、ゲルを重ねる際に端からゆっくりと重ねる。 上記のことを守れば気泡は入らなくなる。 空気抜きは試験管でコロコロするのに頼るのではなく、重ねるときにどれだけ空気を除くのかが重要である。

名無し先生 削除/引用 No.3314-9 - 2014/08/27 (水) 10:28:18 - みこ 詳しい原理まで書いてくださってありがとうございます。 泳動したタンパクがゲル内でどうなっているのかとても気になっていましたのですっきりしました。 （ゲル表面上にも浮き出ているのかなど色々考えていました） ゲルも１０％以上なら案外破れにくいとのこと。 私は小心者なのでビクビク触って、手が震えるからだめなんでしょうね。。。 次回からは気持ちを楽にしてラフに扱ってみます。 ご教授ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3314-8 - 2014/08/26 (火) 20:36:20 - 名無し 触れたくらいでは吸着しませんので心配ないです。てか、そのくらいで容易に吸着するなら、わざわざ電気流す必要ないわけで。ウェスタンの場合、ゲル内から膜に向けて電気で引っ張って膜上にトラップすることで強制的に吸着させているのです。　またアクリルアミドゲル中の蛋白質は簡単には拡散しません。 ゲルの扱いですが、器具使うよりも手でつまんだ方がかえって失敗しないです。10%以上のゲルならば無理に引っ張ったり、へんな持ち方しなければそんなに簡単に切れませんので、わりとラフというか大胆にあつかっても大丈夫とおもいます。てか、ゲル持つときに変に慎重になりすぎるほうが切れたりして失敗することあります。

みみ先生 削除/引用 No.3314-7 - 2014/08/26 (火) 15:59:57 - みこ 置き直していらっしゃるんですね。 私は今のところ１０％のゲルを使っています。 まだ慣れなくてすくいあげるときにいつも緊張して手が震えてしまいます。 たしかに置きなおした方がまっすぐになって写真を撮るときにもいいですね。 ご教授ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3314-6 - 2014/08/26 (火) 15:55:34 - みみ 全然OKですよ。 むしろ６％くらいの緩いゲルの場合、置き直してゲルが変な方向に伸びないようにするとバンドが歪まず真っ直ぐになりやすいです。

ぬ先生 削除/引用 No.3314-5 - 2014/08/26 (火) 15:50:01 - みこ お好み焼きのコテ！ 確かにバッファーからすくうのに楽そうですね。 貴重な情報ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3314-4 - 2014/08/26 (火) 15:42:27 - ぬ ピンセットでつまむと千切れそうなので、ゲルを移すときにはお好み焼きの「こて」を使っています。100円ショップで売っていた小さめのものです。 バッファーの中で膜とゲルを浮かせて重ねたものをこてでそっとすくって、ブロッターに移しています。

おお先生 削除/引用 No.3314-3 - 2014/08/26 (火) 12:51:23 - みこ 早速のご回答ありがとうございます。 ちょっと安心しました。 先輩にも正直にゲルをメンブレン上で動かしたことを伝えましたが、先輩も泡が入ったり、ゲルを曲がっておいてしまった時には動かしているとのことでした。 ただしちょっとでも電圧をかけてしまってから動かすと動かした跡が残るよと言われました。 おお先生が仰るように電圧をかけてからのシグナルは強いというお話とぴったりでした。 ご教授ありがとうございます。 早く手が震えないくらい実験に慣れるように頑張ります。

(無題) 削除/引用 No.3314-2 - 2014/08/26 (火) 12:25:44 - おお 経験上多少の接触は大丈夫です。ただし非常に強いシグナルがでるこうたいだとで、その蛋白がたくさん含まれたゲルをつかうとまれに出ることがあります。まあ1000倍以上はトランスファーしたシグナルと違うような感触なので、抗体濃度を適切な量にすればまずだいじょうぶだとおもいます。

PVDF膜上でゲルを動かしてもいいものでしょうか？ 削除/引用 No.3314-1 - 2014/08/26 (火) 12:02:28 - みこ いつもお世話になっております。 卒研のウェスタン初心者です。 PVDF膜にSDS-PAGE後のゲルを転写のために重ねるときに緊張して手が震えて一回でうまくのせられず、今日はゲルがPVDF膜の上でクシャっとなってしまいました。 なんとか丁寧に拡げて転写しましたがPVDF膜はさわっても跡がつくくらいタンパクの吸着力がいいと先輩に言われたので失敗してしまったようで不安です。 電圧をかけなければPVDF膜にタンパクは吸着されないのですか？ このようにメンブレン上でゲルを動かしたりするのは良くないのはわかっていますが、うまくなるまでの間、どの程度までならゲルを動かしたりしても大丈夫なのでしょうか？ もちろん、大丈夫というのは個人差があるので一般的にどのくらいまで諸先生方が行っているのか知りたくて質問させていただきました。 あとゲルをのせる際にいつもゲルが切れてしまいそうで緊張して手が震えてしまします。 うまくメンブレンにゲルを重ねるコツがありましたらご教授ください。

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