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(無題) 削除/引用 No.3315-8 - 2014/08/29 (金) 11:11:35 - おお >[Re:7] ~さんは書きました : > 私が浸かっていたNHFは10-15分くらいかけて細胞間の接着がなくなるまで剥がさないと > 細胞塊ができてしまうので、時間を長くする方ばかり考えていました。 あ、とくにほかのコメントをみて書いたことではないので、、、あと補足説明ありがとうございます。いろいろなケースがありそうですね。そう言う細胞はいきなり培地でけんだくするより、PBSとかでけんだくしてから培地にまくといいかもしれませんね。 ようは顕微鏡で確認しながら、細胞の性質を把握してその細胞のbestな条件を見つけることは大事でしょうね。場合によってはトリパンブルーなどでviabilityをチェックしながらやるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3315-7 - 2014/08/29 (金) 10:27:32 - ~ >ファイブロはものによってははがれやすくって、PBSやトリプシンEDTA入れただけですぐにはがれてくるようなものもありますから、顕微鏡で観察しながら、はがれてきたらすぐに次の操作に移るといいかと思います。 そういう繊維芽細胞もあるのですか。 私が浸かっていたNHFは10-15分くらいかけて細胞間の接着がなくなるまで剥がさないと 細胞塊ができてしまうので、時間を長くする方ばかり考えていました。

(無題) 削除/引用 No.3315-6 - 2014/08/29 (金) 09:57:03 - おお >トリプシン/EDTAは市販の0.25%トリプシン含のものを使用しております。 >処理時間は37度で2-3分です。 ファイブロはものによってははがれやすくって、PBSやトリプシンEDTA入れただけですぐにはがれてくるようなものもありますから、顕微鏡で観察しながら、はがれてきたらすぐに次の操作に移るといいかと思います。 場合によってはピペッティンぐが強すぎて細胞が弱ってしまっているかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3315-5 - 2014/08/28 (木) 17:23:36 - ~ >トリプシン/EDTAは市販の0.25%トリプシン含のもの >処理時間は37度で2-3分です。 これは比較的はがれやすい性質をもった細胞向けのプロトコルではなく、その霊長類の繊維芽細胞用のプロトコルなのでしょうか？ 同じ種の細胞での継代条件があるかは分かりませんが、一度、セルバンク等でヒト等の正常繊維芽細胞の継代条件を確認されてみてはいかがでしょうか。 顕微鏡で見ながら行えば、その細胞や実験操作に適した条件を見つけることができるでしょうけれども、その前段階としてどの程度の処理をしているかを知っておくことは有効でしょう。 今の条件を標準とすると、かなり長めのトリプシン処理を行うこともあります。その時に、どの位長くトリプシン処理を行うことがあるかと知っていれば、安心して操作ができるでしょう。

ご意見有難うございます。 削除/引用 No.3315-4 - 2014/08/28 (木) 16:20:32 - 細胞培養初心者 ~様、名無し様 貴重なご意見有難うございます。 トリプシン/EDTAは市販の0.25%トリプシン含のものを使用しております。 処理時間は37度で2-3分です。 継代前の細胞の分散や細胞懸濁液の回収の際沈殿した部分の除去など皆様からのご意見を基に実施したいと思います。 有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.3315-3 - 2014/08/26 (火) 20:59:17 - 名無し 継代の時、細胞の分散が不十分で不均一になって、細胞塊の部分に含まれる細胞が塊のままの状態で増殖して、そう見えてるだけではないかと察します。継代する際に、顕微鏡で見て大半がシングルセルになるくらいまでピペッティングするなどして気をつければ避けられるでしょう。ただトリプシン処理時間が長すぎると一部の細胞が死んで壊れてDNAなどが出てかえって塊ができやすくなり、生細胞数も減るので、加減には注意してください。 細胞の上に細胞が乗るようにして上に向けて盛り上がってくるように増殖するようならば、トランスフォームした細胞集団の可能性もなくはないですが、こういうのは何度も継代していたり、長期間コンフルエントのまま置いたりとかする過程で、たまたま見つかるというかんじのものですので、一度にいくつも生じるというのは考えにくいので、やっぱ前者かなあとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.3315-2 - 2014/08/26 (火) 16:16:43 - ~ 霊長類の繊維芽細胞はヒトのものしか使ったことがありませんが。 その培養法のプロトコルはどこから持ってきたもので、 培養について経験豊富な方に直接操作を教わっていますでしょうか？ 細胞の継代では処理時間やピペッティングの仕方が重要ですが、文字や数字で伝えるのは難しいです。 トリプシン処理が甘いと繊維芽細胞が凝集し、コロニー状の細胞塊になることがあります。 また、繊維芽細胞は比較的コンフルエントになっても変質しにくいと思います。 そのため、細胞培養初心者さんが細胞塊を見ていたとしてもおかしくはないと思います。 ただ、トリプシン処理前の細胞の状態が分かりませんので、細胞の変質の可能性やその他のトラブルの可能性も否定できません。 ・トリプシンの処理時間を長くすると細胞塊が生じにくくなるかもしれませんが、CFUが下がるかもしれません。 ・今のトリプシン/EDTAの濃度が分かりませんが、PBSで希釈して長めに処理すると、だまの減少とCFUの低下防止の両方に効くかもしれません。 ・一度細胞塊ができてしまうと、それをほぐすのは困難です。チューブに細胞懸濁液を取れば細胞塊はすぐに沈むので、その部分を捨てた方がいいかもしれません。

Fibroblastの形態の変化について 削除/引用 No.3315-1 - 2014/08/26 (火) 14:00:24 - 細胞培養初心者 皆様 初めまして、霊長類の細胞（皮膚由来）を培養しているのですが、通常の方法で培養しているFibroblastの形態がコロニー様の細胞が多数確認されてしまいました。 初めて培養していてこの様な状態になってしまい、オーバーコンフルによる形態変化なのかあるいは細胞塊になっているだけなのか判断できません。 同じような経験をされた方が居りましたら是非ご指導ください。 よろしくお願いします。

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