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(無題) 削除/引用 No.3316-15 - 2014/09/24 (水) 11:46:21 - aca 返信遅れてすいません。 新たに2kｂほどのRNAプローブでin situを行ったところ驚くぐらい強いシグナルを確認できました！ 今まであれこれ実験条件を検討していたのですがプローブの伸長が一番の近道だったみたいです。 沢山の方にアドバイス頂きありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3316-14 - 2014/08/31 (日) 10:28:31 - ぺーぺー プローブが別のスプライスフォームだったりしませんか？ sequencingで配列は確認済みだったら問題ないでしょうが。

(無題) 削除/引用 No.3316-13 - 2014/08/28 (木) 16:59:17 - aca ポジコンとして用いている遺伝子においてはシグナルが確認できていたので固定時間に関しては問題ないと思っていたのですが、数コピーしかない遺伝子だと気をつける必要があるんですね。今までは組織全体を固定していたのですがいくつかに切って短時間で固定も行ってみます。

(無題) 削除/引用 No.3316-12 - 2014/08/28 (木) 09:59:54 - AP NBT/BCIP発色では、PVA（ポリビニルアルコール）添加で増感する方法もあります。 Rocheのハンドブックを御覧ください。 http://roche-biochem.jp/prima/prima_molecular_biology/dig_for_in_situ_hyb/index.html

(無題) 削除/引用 No.3316-11 - 2014/08/28 (木) 09:54:46 - AP >組織を採取後4% PFA/PBでO/N、翌日スクロース置換を行い包埋という流れです。 O/N固定というのも気にかかるところです。 PFA固定の場合、FAの浸透速度が遅い一方、固定反応自体は比較的速い速度で進行します。 O/Nしなければ組織の深部まで固定液が浸透しないというのであれば、深部は無固定のまま長時間放置されることになります。その間、RNAが無防備な状態になります。逆に、短時間で浸透しているのに長時間置けば過固定になり、検出感度を下げる原因になります。 素早く浸透するように組織を出来る限り小片にした上で、固定は短時間にするほうが良いと思います。手引書などでは3-4時間程度と書かれているものが多いようです。

(無題) 削除/引用 No.3316-9 - 2014/08/28 (木) 08:10:05 - おお 経験は皆無ですけど、やはりプローブの位置(つまり目当てのターゲットのどの部分の配列にするか)で感度が変わったり、シグナルがでなかったり、バックグランドがでたりといろいろバリエーションがあるみたいです。なので複数箇所で試してみて、弱いけどシグナルがありそうならそう言うのを何個か集めてコンビネーションで検出するとかでしょうか。 ものによってはターゲット以外のものを拾う可能性があるので、その辺はやはり確認しながら結論を出していかないといけないかと。ノーザンで確認というのは確かに手だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3316-8 - 2014/08/27 (水) 15:54:06 - AP >RNAの領域によって反応性が異なるというのは原理的にはどのような理由から生じるのでしょうか？ 経験上のことなので、理屈は想像するしかないですが、 ・配列、領域によって高次構造の取りやすさが違う。 ・塩基組成の偏りなどによってハイブリの安定性（Tm)が異なる。 ・塩基組成の偏りによって標識の量が異なる。 ・標識の量によってハイブリの安定性が異なる。 RI標識ではなくパプテンラベルだと、標識を入れることで物性も変わってきます。

(無題) 削除/引用 No.3316-6 - 2014/08/27 (水) 15:17:03 - aca ありがとうございます。プローブを伸長し、加水分解を行ってみようと思います。 RNAの領域によって反応性が異なるというのは原理的にはどのような理由から生じるのでしょうか？ また現在設計したプローブは違う組織でRI in situを行っている20年前くらいの論文を参考にしています。反応性が異なるのは別組織なのが理由、またはRIとnon RIの感度の違いが理由なのでしょうか。 ノーザンブロットは今まで行っていながったのですがやはり堅実に進めるならやるべきですよね。アドバイスありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3316-5 - 2014/08/27 (水) 12:37:39 - AP 単に長いプローブのほうが一標的分子あたりの標識数をあげられるというだけではありません。標的RNA配列の一部分だけをカバーするプローブでは選ぶ領域によって結果が異なることがあるというのもポイントです。 異なる領域から、同じような長さで同等の標識効率のプローブを候補として試すと、あるプローブだと良好な結果が得られたけれど、検出できなかったということもあります。最初から長いプローブにしておくと、できたプローブがよくない配列領域だけしか含まないという危険性を避けられますね。逆に、短めのプローブでも、異なる領域のものをいくつか試すと、成績のよいものが見つかるかもしれません。 注意する点としては、単純にプローブを長くすると反復配列が含まれてしまいoff-targetを検出してしまう可能性があることです。その場合は、反復配列領域を除いた、複数の領域のプローブをミックスするというのも手でしょう。 いずれにせよ私は、ISHに使用するプローブはNorthern blotで使ってみて、標的RNAが検出可能であり、非特異的標的を検出しないことを確かめてから用いています。

(無題) 削除/引用 No.3316-4 - 2014/08/27 (水) 09:57:29 - が プローブがカバーする領域を最大限に広げるべき。 例えば全長cDNAからプローブを作成すれば、シグナルは高くなります。 もちろん最終的なプローブの長さは300 bp程度にとどめるべきです。

(無題) 削除/引用 No.3316-3 - 2014/08/26 (火) 21:35:25 - aca すいません。情報が不足していたのですが、免疫染色も並行して行っており、組織においてどの細胞に発現しているのかはおおよそ目星はついています。しかしin situではシグナルが確認できていないという状況です。 やはりプローブを長くするのが優先ですか。私自信経験がないのでわからないのですが、プローブを数倍の長さにした際、見えないシグナルが見えるようになるというのはよくある話なのでしょうか。加水分解も試してみたいと思います。 ロスについてはあまり考えていませんでした。現在ラボで行っているのは、組織を採取後4% PFA/PBでO/N、翌日スクロース置換を行い包埋という流れです。切片をスライドガラスに張り付けた後は20分室温で乾燥させ、処理をしています。組織のRNA保持のために何か有効な手段があったら是非教えて頂きたいです。

(無題) 削除/引用 No.3316-2 - 2014/08/26 (火) 19:33:44 - AP なんでも、理論的には一細胞数コピーの標的RNAがあれば検出できるポテンシャルがあるそうなので、発現が低くてもたいていは見えるはず、と思ってやっています。 発現量が低いと一口にいっても、標的組織中の細胞に広く浅く発現しているのか、限られた細胞でしか発現していないけれどそれらの細胞では結構発現しているというのでも、難しさが違ってくるでしょうね。 原理的に言って、プローブを長くするのは有効です。ただし、ひとつづきの長いプローブとして合成した場合、組織に対する浸透性を高めるために断片化が必要になってきます。カバーする領域の異なる数種類の短いプローブをミックスするというのもよい手です。 発現量の少ない標的の場合、試料のプレパレーションの過程でのロスがクリティカルになってくると思います。そのへんの工夫は如何なされていますか。 固定組織片のホールマウントでISHしておいて、それを包埋、切片として検出をする方法もなにかで読んだこともあります。

発現量の少ない遺伝子へのin situ hybridization 削除/引用 No.3316-1 - 2014/08/26 (火) 14:44:16 - aca いつも参考にさせていただいてます。 凍結切片によるスライドガラス法in situ hybridizationを立ち上げようとしています。 現在、DIG標識RNA、NBT/BCIPを用い、同じ組織でin situ hybridizationを行っている論文のプロトコールを参考にし発現が既に確認されている遺伝子をポジコンとして実験を行ったところきれいなシグナルを確認できました。このことから実験手技としては問題がないと考えています。 しかし、自分の研究テーマの標的遺伝子(遺伝子発現、タンパク発現はPCR、WBなどで確認済)に対してin situを行っても全くシグナルが確認できません。TSAを用いて増感も試みたのですが時間をかけてもシグナルが出てきません。PCRの結果から、おそらく発現量が少ないのが原因だと考えています。 ハイブリ温度を65℃から55℃に下げたり、プローブ濃度を上げるなども試しましたが良い結果は得られませんでした。 プローブの長さは350b前後です。次に条件検討としてはプローブの長さをもっと長くすべきなのかなあとは思っているのですが、発現量の少ない標的に対して効果的な手法が何かないのかご意見を伺いたいです。宜しくお願いします。

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