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(無題) 削除/引用 No.3340-2 - 2014/09/03 (水) 13:31:35 - おお >[Re:1] 初心者ですさんは書きました : > 細胞にSDS−lysis-buffer（+2ME）を直接加えて、９５℃で１０分ボイルしてサンプル調製、SDS−PAGEを行っています。 > いろいろこちらのフォーラムを参考にさせていただき、９０℃に下げたり、ボイルの時間を短くしたりなどもしてみましたが、粘性が強く残ってしまい、ボイルの時間を結局１０分に延長したりなどしています。 もうちょっとマイルドな条件で蛋白を調せいしたらDNAが完全にとけでなくって楽になると思うけど、、、 あとどうしてもサンプルバッファーというのなら、ニードルに通して粘性をおとすとか、超音波で粘性をおとすとかいう方法はありますけど。確実なポジこんは持っているのでしょうか? ところでほかの抗体でのWBはワークしてるのですよね。 > > ウェスタンでの確認ができていない状態でＣｈＩＰをするのは不安もありますが、ＣｈＩＰで何とかＤＮＡが少しでも落ちれば、タンパク自体が確認できなくても進められるかどうか、と迷っています。 > もし何かご意見頂戴できればと幸いです。よろしくお願いします。 > もし、細胞でも何でもいいんだけど、そう言う系でChipで回収できるはずの遺伝子がその抗体とその細胞をつかって検出できて、ネガこんで検出できない状況なら、ワークしているという判断はできるとおもいます。 ChipのIPフラクションの一部をWBにまわして(WBようのぶんはDNaseなどで完全にきったほうがいですけど)検出できればIPできていることはわかると思いますけど。

ＣｈＩＰの検討中、ＷＢでのトラブル 削除/引用 No.3340-1 - 2014/09/03 (水) 10:37:33 - 初心者です あまり実験の経験がなく、似たようなトピックはたくさんあると思うのですが、 私のケースでどうなのかご意見伺いたく、質問させてください。 内在性のタンパクに対して、プライマリー細胞でChIPを行う予定にしています。 アセチル化ヒストンのChIPは何とかできたものの、 内在性タンパクのＣｈＩＰができません。 （％インプットが低い状態です） 市販のキットも試しましたが、研究対象の細胞はそのキットでは壊れにくいらしく、断念しています。 抗体が悪いのか、どうかと思って、ウェスタンを試してみましたが、 ウェスタンでの検出もうまくいっていません。 抗体も２種類くらい試しています。 一般的によくつかわれているだろう抗体で、論文や抗体の会社のＨＰなどではきれいなバンドが見えているのですが、プライマリー細胞、細胞株何種類か試しても、見えていない状況です。 （mRNAレベルでの発現は確認しています） もう１，２種類の抗体は試したいと思っていますが、高いのでどうかと迷っています。 当初は、ChIPのための固定をして、断片化した後のサンプルでのウェスタンを行っていましたが、うまくいかないため、 細胞にSDS−lysis-buffer（+2ME）を直接加えて、９５℃で１０分ボイルしてサンプル調製、SDS−PAGEを行っています。 いろいろこちらのフォーラムを参考にさせていただき、９０℃に下げたり、ボイルの時間を短くしたりなどもしてみましたが、粘性が強く残ってしまい、ボイルの時間を結局１０分に延長したりなどしています。 ウェスタンでの確認ができていない状態でＣｈＩＰをするのは不安もありますが、ＣｈＩＰで何とかＤＮＡが少しでも落ちれば、タンパク自体が確認できなくても進められるかどうか、と迷っています。 もし何かご意見頂戴できればと幸いです。よろしくお願いします。

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