全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3383-13 - 2014/09/20 (土) 10:41:09 - おお >[Re:12] Lさんは書きました : > IRES-puroの問題だったとしても、マルチコピーで入れば薬剤耐性コロニーが増えるかもしれません。 これってコントロールとの比較をかんがえたとき、いいことなんでしょうかねぇ。。。もちろん同じタイターで同じpuro濃度でもマーカーの発現に差があれば、コピー数がコントロールと違ってくる可能性はありますけど。 なのでそこは厳密にコントロールできない実験系だということで実験をするしかないかと。。。 もちろんタイターをそろえてからの方が絶対にいいですけどね。

(無題) 削除/引用 No.3383-12 - 2014/09/20 (土) 10:04:20 - L empty vectorと比べてinsertを入れたvectorの感染効率が悪い（タイターが低い）のか、同等の感染効率だけどIRES下流のpuro耐性遺伝子の発現がinsertが入る事により下がるのか、この状況では区別できないように思います。 lentivirusをお使いとの事なので、とりあえず濃縮してMOIを上げて見てはどうでしょう？　低タイターが原因の場合はこれで解決するでしょうし、IRES-puroの問題だったとしても、マルチコピーで入れば薬剤耐性コロニーが増えるかもしれません。 また、同じinsertでIRES-GFPにつないだ場合はどうでしょう？　insert無しと比べて、感染効率に差が出たり、感染細胞でのGFPの蛍光が下がったりしますか？

(無題) 削除/引用 No.3383-11 - 2014/09/19 (金) 13:36:15 - MP Clontechで売られているIRESpuroなどは、わざとpuroの翻訳効率が悪くなるように設計されているはず（こうすることで全体の転写量が多いものを選択する＝目的の遺伝子の発現を上げる）。Clontechのものの流用であれば、それもひとつの原因かも。puroのMetを効率よく翻訳される位置に変えれば解決できるかも（かなり面倒くさいが）。

(無題) 削除/引用 No.3383-10 - 2014/09/19 (金) 12:53:20 - おお 1キロならながさでいってそんな影響が出るような気がしないけど、単純に長さだけではないと思うのでまあその結果について驚かないですけど。 たいたーとかそろえてるなら、インサートのなんがしかの影響が出たんでしょう。 puroの濃度をいじるのは、結局下げて思うように調整されるかわからないわけで、そのつもりで細胞をつかいつづけてたけど、じっさいはそうでなかったりということもありそうなのであんまり良い方法ではないとおもいます。 あとは、emptyの方をくふうするかですね。ダミーとして目的のいでんしのanti senseをいれるとか、活性を持たない(キナーゼならその活性をつぶしたとか)mutantをいれるとかでしょうか。anti senseだと配列が全く違うので同じようにpuroの発現効率が動くかわかりません。

(無題) 削除/引用 No.3383-9 - 2014/09/18 (木) 17:04:24 - 774R >・・・という流れに読み取れるけど。 今となってはそう読み取れるネ

(無題) 削除/引用 No.3383-8 - 2014/09/18 (木) 16:44:05 - len >[Re:7] 774Rさんは書きました : > >今回IRESの後ろにpuro selection markerを置いたplasmidを使用したのですが > > plasmidを使用したのにレンチですと？？ なにをそんなにつっかかっているのか？ レンチウイルス作製用の"plasmid"についての話で、IRES-puroの"plasmid"とtarget-IRES-puroの"plasmid"をpackaging "plasmid"と一緒にpackaging cellに"transfection"して、できたウイルスを"infection"した、という流れに読み取れるけど。 何が問題か、ちゃんと書いたら？ stableのラインをとるのが目的であれば、今の条件で生き残っている細胞を増やせば問題はないと思うし、断続的にpuromycinを入れて（1-2日いれて除いて、増えてきたらまた入れて）セレクションすることもできます。

(無題) 削除/引用 No.3383-7 - 2014/09/18 (木) 16:11:45 - 774R >今回IRESの後ろにpuro selection markerを置いたplasmidを使用したのですが plasmidを使用したのにレンチですと？？

(無題) 削除/引用 No.3383-6 - 2014/09/18 (木) 12:30:20 - ai ありがとうございます。 レンチでインサートは1k弱です。 うまくいかなければtransfectionも考えてました。

追記 削除/引用 No.3383-5 - 2014/09/18 (木) 11:34:43 - mon >[Re:4] 774Rさんは書きました : > plasmidならinfectionではなくtransfectionでは？ すいません。勝手にretrovirusベクターだと思い込んでいました。 retrovirusだとしてもinsert（の長さ等）によって、得られるウィルス力価が減少することがあります。

(無題) 削除/引用 No.3383-4 - 2014/09/18 (木) 11:20:56 - 774R plasmidならinfectionではなくtransfectionでは？

(無題) 削除/引用 No.3383-3 - 2014/09/18 (木) 10:26:07 - mon IRESは転写後高次構造を取るRNAとして機能しますので、前部のインサートの配列によりIRES機能に影響がでているのかもしれません。 puromycinの濃度は、（多コピー導入株を分離するのでなければ）細胞増殖阻止・細胞死を引き起こす最小の濃度として、あらかじめお使いの細胞で決定した数値でないのですか？そうであれば、濃度を変えることは非導入細胞も増えてくるだけなので現実的ではありません。細胞死に至らないけど増殖にかなり差がでるなら濃度を下げるのも有りだと思います。 経験上、かなりの癌細胞はpuromycin1~2ug/mlで良く効きますが、0.05ug/mLの細胞もありました。 なお、コンストラクトを作り直すより、MOIを上げれば目的は達成できるではないでしょうか。 もし、耐性細胞数が少ない事＝ウィルスゲノムの挿入部位の傾向がempty vectorと変わる、と考えこれを嫌うのであれば、前部のインサートの配列とIRESの間に20-50bpのspacer配列を挟むと良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.3383-2 - 2014/09/18 (木) 10:21:51 - おお How long is your insert in the vector?

IRES 削除/引用 No.3383-1 - 2014/09/18 (木) 10:05:42 - ai いつも勉強させてもらっています。 今回ご質問させていただきたい点はIRESについてです。 IRESの後ろにGFPやlucなどマーカーをおくと，IRES前の配列の発現に比べて，後ろのマーカーの発現は低いというのは経験しますし，よく言われていると思います。 今回IRESの後ろにpuro selection markerを置いたplasmidを使用したのですが，infection後のpuro selection時の生細胞数がempty vectorに比し，極端に低くなってしまいました（目視概算で1/10以下）。 上述の通りIRESの後ろにGFPなどの入ったものを使った事はありましたが，puro-rは初めて使用したのですが，こんなに極端に差が出るものなんでしょうか？ empty vectorを見るとinfection効率は悪くないようです。 こういった場合，selectionはどのように行っていけばいいのでしょう？ selectionなしも考えましたが，やはりpurityを上げたいと思っています。 いいアイディアをお願いします。 ちなみにpuroは2ug/mlで使用しており，濃度を薄くすることも考えています。

全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---