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(無題) 削除/引用 No.34-7 - 2012/01/13 (金) 10:07:00 - AP >Oligo　dTプライマーをつかっています。 では、繰り返しになりますが、ランダムプライマーで逆転写してみましょう。 逆転写反応は、鋳型RNAの利用効率があまり高くないうえ（通常、鋳型RNA量に対して50%以下のcDNA産物量、20%くらいいけば上出来な方）、伸長性も高くないのでプライマーからの距離が大きくなるほどcDNAでカバーされにくくなります。 定量PCRのように、RNA全体、全領域をバイアスをかけずにcDNAでカバーするのが望ましい場合にはランダムプライマーの方が向いています。

(無題) 削除/引用 No.34-6 - 2012/01/13 (金) 08:38:12 - う 目的の遺伝子に対するプライマーを複数作製して 試すとか、は考えないのでしょうか？ ＞しかし、どんなにやってもその目的遺伝子のバンドがみえません。 どんなにやったのか？わからないとアドバイスが無駄になる気がします。

(無題) 削除/引用 No.34-5 - 2012/01/12 (木) 23:27:24 - Foo RNA自体のクオリティーは、アガロースゲルで流せば分かりますが、その辺りは如何でしょうか。plantでどう見えるのかは分かりませんが。 >ちなみに、ポジコン（ＤＮＡ） こういう質問では、用語は意識して正しく用いたほうが良いと思います。Harmoniaさんのご質問にもありますが、これは何ですか？ネガコンでゲノムDNAを用いた、というのなら分からなくもないですが。 plantのactinがどうかは存じませんが、例えばマウスの場合、actinは偽遺伝子が山ほどあり、イントロンを挟んで設計したつもりでも、ゲノム上の別のactin偽遺伝子が単に増幅されていることもあります。

(無題) 削除/引用 No.34-4 - 2012/01/12 (木) 23:01:02 - シワ ご指摘ありがとうございます。 Oligo　dTプライマーをつかっています。 プライマーはすべてイントロンを挟むように設計しているので、 DNAの増幅ではないと思います。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.34-3 - 2012/01/12 (木) 22:02:05 - AP >逆転写はオリゴプライマーつかっています。 オリゴプライマーとは何ですか？　普通そういう呼び方はないはずですが。 oligo-dTですか？　oligoのランダムプライマー？ oligo-dTなら、ランダムプライマーにすれば改善するかもしれません。 oligo-dTだとpoly-A tailから離れるほど逆転写が伸びにくくなるので、そういう領域を標的にするとPCRの鋳型になりにくくなります。植物はどうか知りませんが、poly-A tailのないmRNAもありますし。 ポジコンのactinは、イントロンを挟んだPCRですか？　実はゲノムDNAからの増幅で、cDNAの生成はうまくいっていないとか。

(無題) 削除/引用 No.34-2 - 2012/01/12 (木) 22:00:57 - Harmonia ダメなときの可能性は沢山ありすぎて、何を書いていいかわかりません。 問題点を発見するために、もっと具体的に書いてください。 プライマー設計は何を根拠にその配列を選んだのでしょうか？ actin 以外の、もっと発現量の少ない遺伝子ではどうでしょうか？ ポジコンは？クローン化したプラスミド？抽出したゲノム？ そもそもその遺伝子の発現が見える根拠は？

RT-PCRによる特定遺伝子発現量半定量 削除/引用 No.34-1 - 2012/01/12 (木) 21:27:58 - シワ 現在、シロイヌナズナを用いた研究をしています。 そのなかで、注目した遺伝子の発現量を観察したいと思っています。 そこで、Plant RNA reagent(Invitrogen)を使って、RNAを抽出して、 Superscript �Vで逆転写して、PCRで目的遺伝子を増幅して、発現量を確認しようとしています。 しかし、どんなにやってもその目的遺伝子のバンドがみえません。 コントロールとして、actinを一緒に流していますが、 そっちはきちんとバンドがみえましたから、抽出はOKだと思います。 ためしに、逆転写の温度を5度（50度→55度）に上げて、やってみましたが、 だめです。 セカンドPCRやPCRのステップをいろいろいじっても見えませんでした。 正直、何がだめなのかがわかりません。 すみませんが、どなたかご教授お願いします。 ちなみに、ポジコン（ＤＮＡ）でプライマーの設計がおかしくないことは確認していて、逆転写はオリゴプライマーつかっています。

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