コメント、ありがとうございます。
~さん、
いくつかのタンパク質を哺乳類の細胞から採取して、実験に使いたいため、293かCHOに発現させようとしています。CHOのほうが多くのタンパクを取れるよと聞いていたので、試してみたのですが、このTransfection効率のところでまずひっかっかっています。これが一般的なことなら、293に戻るのですが、もしかすると何らかの手技の問題ではと言うことで、皆さんにお伺いさせていただいています。
monさん、
情報ありがとうございます。
Lifetechに聞いてみたいと思います。
おおさん、
ソーティングも考えているのですが、なにぶんこれほどまで入らないと思っていませんでしたので、本当にそうなのか、まずはそこをクリアーにしたいと思っています。
Transfectionの際はRPMI、血清入りを使っています。
無血清培地を使ってみたのですが、それほど効果的ではなかったため、それ以降血清培地を使っています。
kさん、
ご指摘ありがとうございます。
今は48Wellの系で試しているところです。
Lipofectamine2000では前日に細胞をまいて、次の日は80-90%Confluencyです。
25ul Opti-MEMIにPlasmidを0.5ug入れます。
同じく25ul Opti-MEMIに1ul Lipofectamine2000を入れて、5分間待ちます。
それぞれのMixtureを混ぜて、さらに20分待ちます。
それをCHOに加えて、3日後にHarvestします。
評価はGFPの蛍光を顕微鏡で見るのと、さらにCell lysateをMicroplate readerでGFPのIntensityを計りました。目的タンパク質はWesternでみています。結果は断然Lipofectamineがよく、次にX-treme>TransPass=jetPRIME>FugeneHD、そしてもっともひどかったのがTransIT-CHOでした。 |
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