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(無題) 削除/引用 No.3477-13 - 2014/10/23 (木) 19:03:57 - GE アドバイスありがとうございます。 ＞＞まずは、ヒト・マウス・ラットで、観察されている分子量を説明できるようなバリアントの有無を調べてはいかがでしょうか。 ヒトのスプライシングバリアントで分子量がそれらしいものが1つありました。RT-PCCRで試してみたいと思います。 ノーザンは昔やったことがあります。検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3477-12 - 2014/10/23 (木) 11:46:11 - おお ノーザンしてみるのもてだとおもいます。PCRが主流になっているのでしない人も多くなってきたかもしれませんが、PCRはプライまーで挟まれた領域だけをみるもので、ノーザンのように全長がみれませんから。 各エクソンでプローブを作るとかするとサイズに差があればシグナルがでる出ないの比較もできますし。

(無題) 削除/引用 No.3477-11 - 2014/10/22 (水) 19:51:41 - 中年 免疫系や神経系に特異的な機能でもなければ、多くのバリアントは哺乳類で共通していることを期待しても良いように思うのですが。まずは、ヒト・マウス・ラットで、観察されている分子量を説明できるようなバリアントの有無を調べてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3477-10 - 2014/10/22 (水) 18:06:17 - GE みなさま アドバイスありがとうございます。 思ってもいなかった視点をたくさん指摘していただき非常に感謝しております。 ヒト・マウス・ラットではなく、マイナーな哺乳類細胞を使用しておりますので、データベースがそこまでそろっていないのが実情です。 多くの可能性が出てきましたので、どの可能性から最初に取り掛かっていくのか、また、どれができそうなのかじっくり考えてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3477-9 - 2014/10/22 (水) 17:26:47 - おお その蛋白のファミリーがゲノム上で複数見つかっているならそう言う遺伝子のホモロジーとサイズもチェックしておいてもいいかもしれません。p27 kip1の抗体からそのパラログのp57(だったと思う)が見つかったという話もありますし。 KDもやってみるといいかもしれませんが、つかった部位がたまたま短い方にない配列だったらと考えると、何カ所かやらないとなんて思ったり。 もうひとつきになるのはalternative splicingでサイズは一緒だけどエクソン構成が違うとかいう可能性はつぶした方がいいのかもと、、、、 何種類か4base cutterで切れやすいもので切って切断パターンをチェックすればもしかしたらそう言うのが見つかるかも(逆に見つからないからエクソン構成が一緒とはいえませんけど)。

(無題) 削除/引用 No.3477-8 - 2014/10/22 (水) 17:15:38 - おお >[Re:6] 774Rさんは書きました : > エピトープが似てるだけの別のタンパク質の可能性も十分ありますね。 > > > わたしも、ちょっとそこが気になってます。その抗体が抗原認識部位でノンスペをひろっていたら、抗原やエピトープぶいのペプチドでバンドがなくなるので、あまり正確な判断ができないとおもいます。 ペプチド切断とかは可能性があるでしょうからスプライシングだけをみるのはちょっと結論が出ないかもしれません。p53は切れたものが下に見られることはあるようです。 メジャーな実験動物、ヒトであればデーターベースで可能性のあるスプライシングのバリアントが見つけれるかもしれませんので、そう言うのから予測するといいかもしれません。 遺伝子の上流や下流にエクソンがある場合もあるかもしれませんが、単純に2番目のエクソンや1番目のエクソンの途中から始まっているとか、最後のエクソンの前でpolyAがある場合もありますよ。まあプライまーがその短い方の蛋白のmRNAにつけばRACEでもいいかもしれません。ただ頭の方はアクシデンタルにできた短い産物かどうかというのはあるかもしれません。 それと最初のエクソンより外側にありそうであれば、データーベースでのエクソンの予測のほかにtranscription start siteが上流にないかというのも参考になるかもしれません。 それと抗体がどの部分を抗原として作られたかもチェックした方がいいかもしれませんね。でできれば違う部分で作られた抗体なんかも試せればいろいろと絞れてくるかもしれません。ペプチド抗体だととりあえずN末とかC末で作るというストラテジーもありますし。

(無題) 削除/引用 No.3477-7 - 2014/10/22 (水) 17:02:22 - 中年 哺乳類のタンパク質なのでしょうか？ ヒトやマウスならマイナーな転写産物までカバーしているデータが公開されているので、そこにバリアントの情報があるかどうかはすぐに調べられるのでは？

(無題) 削除/引用 No.3477-6 - 2014/10/22 (水) 13:12:22 - 774R エピトープが似てるだけの別のタンパク質の可能性も十分ありますね。

(無題) 削除/引用 No.3477-5 - 2014/10/22 (水) 13:07:58 - GE ~様 アドバイスありがとうございます。 データベースから予想される分子量は40kDaに近いですので、外側にエクソンがあると考えております。 なお、データベース上でのコーディング領域を動物細胞で発現させた場合、40kDaでした。 切断の可能性は考えておりませんでした。 ペプチドシーケンスは、簡単にはできそうにありませんが、考えてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3477-4 - 2014/10/22 (水) 13:07:28 - 独り言 とりあえず、siRNAでノックダウンしても、下のバンドが切れるのであれば、同じ遺伝子産物だと言えるんじゃない。 それで、他の細胞でも見られるのであれば、なにかしらのスプライシングバリアンとがデータベースにあるような気もするけど。

(無題) 削除/引用 No.3477-3 - 2014/10/22 (水) 12:29:56 - ~ あ、スプライシングバリアントだけでなく、40kDのタンパク質が切断されて30kDになっている可能性もありますね。

(無題) 削除/引用 No.3477-2 - 2014/10/22 (水) 12:28:40 - ~ バンドを切り出して、ペプチドシークエンシング。 >データベース上の第一エクソンと最後のエクソン これから想定されるMWは30kDと40kDのどちらに近いのでしょうか？ 分子量と移動度はパラレルではありませんが、 30kDに近いのであれば、外にエクソンがあることを疑いますが、 40kDに近いのであれば、スプライシングバリアントが疑われます。 または、その遺伝子配列をクローニングして、動物細胞で発現させてサイズを見るというのも手ですね。

未知蛋白質の同定 削除/引用 No.3477-1 - 2014/10/22 (水) 12:23:56 - GE 現在、ある蛋白質の全長を抗原として抗体を作製し、ウエスタンブロットをしております。 ウエスタンブロットの結果、目的の分子量（40kDa）の位置に蛋白質は確認できましたが、低分子側（30kDa）にもう一本マイナーなバンドが確認できました。 組換え蛋白質と反応させた抗体を使用したところ、両方のバンドが消失したので、両者とも同じ遺伝子産物ではないかと考えております。 とりあえず、データベース上の第一エクソンと最後のエクソンの位置にプライマーを作製し、RT-PCRを行いましたが、1本のバンドしか見られておりません。別のエクソンが含まれていると考えております。 この場合、低分子側の蛋白質を同定するには、遺伝子の上流、下流に別のエクソンが含まれていると考えて、5'-RACEや3'-RACEを行って同定していくのでしょうか？ こういった場合で、何か他の対策がありますでしょうか？

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