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(無題) 削除/引用 No.3507-7 - 2014/11/07 (金) 15:02:59 - クロリン asanさん ありがとうございます。販売している蛍光標識RNAについて、検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.3507-6 - 2014/11/05 (水) 18:09:50 - asan あまり聞かれないreviewな気がしますが、査読者の意図は何だと思いますか？ lipofectamine2000でsiRNA導入をしている論文は結構あるので質問の意図やトーンよっては、 引用して広く使われている、ノックダウン効率をきちんと示しているという言い訳でもなんとか成る気がします。が、特殊な細胞（プライマリー）ならその細胞の全体での導入効率が知りたいということなのかなあとも思います。 そのような意図の場合は、自分のsiRNAを標識しても良いとは思いますが、通常複数の配列を作製しているでしょうから結局全部つくることは難しいかもしれません。個人的には、オリジナルでAlexa等をつけてワークしなかったらちょっと面倒なきもするので、問題ないなら市販のものをそのままかって示す方が良いかも分かりません。たとえば、 BLOCK-iT™ Alexa Fluor® Red Fluorescent Control なんかで、自分の購入したメーカーであわせるならベストでしょう。効率確認用として前提で販売しているので基本的にはワークすると思われます。

(無題) 削除/引用 No.3507-5 - 2014/11/05 (水) 11:47:17 - クロリン TSさん ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3507-4 - 2014/11/04 (火) 18:02:20 - TS ＞セルフデザインsiRNAに蛍光標識をしたもので，トランスフェクション効率を示す方法になるでしょうか？ そう思います。スクランブルまでやれとは言われないでしょう。標識キットも売られていますが、１つとかであれば、標識したものを新たに購入する方が簡単と思います。 顕微鏡観察したときには、導入細胞の中でも光り方にばらつきがあるとは思いますが、写真で見せるか、文章のみで記載するか、レビューアーの返答のみに含めるかは、レビューアーの指摘のトーンによるかなぁと。

(無題) 削除/引用 No.3507-3 - 2014/11/04 (火) 17:50:51 - クロリン 標的遺伝子のノックダウン（KD）効率は示してあります． 既知の標的遺伝子に関しては，コントロールにnon-target siRNAを使用して，これを基準にして標的遺伝子の何割をKDできたかを示しております．Qiagenの市販siRNAを使用しました． 市販されていないsiRNAはセルフデザインであり，これのコントロールsiRNAは塩基構成をそのままに配列を変えたscrambled siRNAを使用しています． 確かに，Alexaか何かで標識されたsiRNAが売っていますね． セルフデザインsiRNAに蛍光標識をしたもので，トランスフェクション効率を示す方法になるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3507-2 - 2014/11/04 (火) 17:21:12 - TS ターゲット遺伝子のノックダウン効率は示してあるのですよね。 いわゆるトランスフェクション効率を示さなければならない場合、蛍光標識したsiRNAを使い、蛍光顕微鏡で観察・解析するのが1つあると思います。 単に効率をチェックするとか、導入試薬を比較するのであれば、Non-targeting siRNAでもOKとは思いますが（たぶん配列の違いはマイナーですから）、リバイスで求められているのであれば、やはりKDに使用しているsiRNAを使う方がレビュアーを納得させやすいと思います。

siRNAのトランスフェクション効率を示す 削除/引用 No.3507-1 - 2014/11/04 (火) 16:16:28 - クロリン 第1回目のreview結果が返ってきました。 査読者から、「この研究におけるLipofectamin2000を使用したsiRNAのトランスフェクション効率はどれくらいですか？それを示してください。」と指摘を頂きました。 使用する細胞株（primary cellであれば個体差もあるか？）、siRNAのセンス、アンチセンスの長さ、GCコンテント比などが異なれば、それぞれトランスフェクション効率が異なるかと思いますが、一般的にトランスフェクションの効率を示す方法はどの様なものがありますか？ ご教示いただければ幸いです。

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